水稻寡分蘗突變體rcn20的基因克隆與功能研究.pdf

1、水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的糧食作物之一，一半以上的人口以水稻為主食。水稻分蘗是一個(gè)非常重要的農(nóng)藝性狀，一個(gè)分蘗對(duì)應(yīng)一個(gè)穗，分蘗是決定水稻產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。本研究的實(shí)驗(yàn)材料為水稻寡分蘗突變體rcn20，對(duì)該突變體分別進(jìn)行了形態(tài)學(xué)及細(xì)胞學(xué)觀察、基因圖位克隆、組織表達(dá)模式分析以及功能分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.對(duì)粳稻品種圣稻808進(jìn)行EMS誘變，獲得了隱性且能夠穩(wěn)定遺傳的寡分蘗突變體rcn20。該突變體表

2、型為分蘗數(shù)目嚴(yán)重減少，只有3至4個(gè)分蘗，而野生型圣稻808正常有15個(gè)左右的分蘗，同時(shí)植株高度也比野生型略矮。
　　2.采用石蠟切片技術(shù)對(duì)突變體的分蘗芽進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)突變體rcn20的側(cè)生分生組織在幼苗時(shí)期能夠正常起始，分蘗芽能夠形成，但不能伸長(zhǎng)。利用掃描電鏡觀察分蘗芽的表面，發(fā)現(xiàn)突變體分蘗芽表皮細(xì)胞形狀不規(guī)則，而野生型分蘗芽表面的細(xì)胞形狀規(guī)則。因此，突變體rcn20分蘗芽不能正常伸長(zhǎng)與分蘗芽細(xì)胞形態(tài)有關(guān)。微管蛋白免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)

3、，突變體與野生型相比，根尖分生區(qū)與伸長(zhǎng)區(qū)大部分細(xì)胞在有絲分裂間期周質(zhì)微管的排列方向發(fā)生變化，因此導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞不能夠正常伸長(zhǎng)。
　　3.對(duì)寡分蘗突變體rcn20進(jìn)行遺傳學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)它受1對(duì)隱性基因控制。利用圖位克隆的方法將目的基因初定位在第3條染色體上，進(jìn)一步精細(xì)定位在第3條染色體的300kb區(qū)間內(nèi)。對(duì)其中的候選基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)LOC_Os03g01530（命名為RCN20）發(fā)生了突變，其編碼區(qū)第616位核苷酸由G突

4、變?yōu)锳，導(dǎo)致第206位氨基酸由丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸。通過(guò)將該基因的野生型基因組DNA轉(zhuǎn)入突變體rcn20中，發(fā)現(xiàn)突變表型得以恢復(fù)，從而證實(shí)該基因就是促進(jìn)分蘗芽伸長(zhǎng)和調(diào)控分蘗數(shù)目的目的基因。經(jīng)BLAST分析，發(fā)現(xiàn)目的基因RCN20編碼β-tubulinⅡ蛋白。
　　4.實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，RCN20基因在水稻分蘗芽中特異表達(dá)程度最高，其次在葉鞘、幼穗、根中表達(dá)量較高。構(gòu)建了由RCN20基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)報(bào)告基因GUS表達(dá)的轉(zhuǎn)

5、基因水稻，通過(guò)GUS染色分析各組織部位表達(dá)情況，得到結(jié)果與以上相似。
　　5.作為T(mén)CP家族轉(zhuǎn)錄因子，OsTB1具有抑制分蘗芽伸長(zhǎng)的功能。構(gòu)建了寡分蘗突變體rcn20與多分蘗突變體tb1的雙突變體，發(fā)現(xiàn)雙突變體的表型趨向于rcn20，確定基因RCN20在OsTB1的下游。通過(guò)比較OsTB1與RCN20基因在突變體tb1與野生型臺(tái)中65、獨(dú)腳金內(nèi)酯受體突變體d14與野生型圣稻808中的表達(dá)變化，推測(cè)OsTB1對(duì)RCN20的表達(dá)具有抑

6、制作用。
　　6.通過(guò)凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)和染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)（ChIP）分析，驗(yàn)證了OsTB1蛋白能夠與RCN20啟動(dòng)子區(qū)的相應(yīng)核心序列結(jié)合，說(shuō)明OsTB1對(duì)RCN20基因表達(dá)具有直接調(diào)控作用。
　　7.通過(guò)熒光素酶(Luciferase，LUC)報(bào)告基因在水稻原生質(zhì)體瞬間表達(dá)，檢測(cè)OsTB1的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)一步證實(shí)了OsTB1對(duì)RCN20的表達(dá)起明顯抑制作用。構(gòu)建了OsTB1基因受地塞米松(DEX)誘導(dǎo)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻