大豆葉形突變體的遺傳和功能分析.pdf

1、大豆[Glycine max L.Merr.]屬于豆科、蝶形花亞科、大豆屬，是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟(jì)作物，為人類提供了大量的植物蛋白以及油料。大豆是古四倍體，基因組大小為1.1 Gb，編碼蛋白質(zhì)的基因超過(guò)46430個(gè)，其中大約有75％的基因是以同源基因的形式出現(xiàn)的。由于大豆基因組復(fù)雜，遺傳轉(zhuǎn)化較為困難，一直以來(lái)對(duì)大豆基因功能的研究進(jìn)展較為緩慢。隨著大豆基因組序列的公布，大豆遺傳學(xué)研究邁入了新的時(shí)代。本文通過(guò)篩選菏豆12突變體庫(kù)，獲得葉皺縮

2、表型的突變體。通過(guò)重測(cè)序技術(shù)獲得菏豆12基因組序列信息，并與參考基因組Williams82進(jìn)行序列比對(duì)得到數(shù)量眾多的插入缺失片段的物理位置信息，并以此開發(fā)新的插入/缺失（INsertion/DELetion,INDEL）分子標(biāo)記。與此同時(shí)構(gòu)建突變體與Williams82的雜交群體，并通過(guò)正向遺傳學(xué)的手段，對(duì)造突變的基因進(jìn)行圖位克隆，利用表型相同的突變體株系之間雜交進(jìn)行等位鑒定，以及突變體轉(zhuǎn)基因恢復(fù)表型等手段確認(rèn)了該突變體的突變基因。進(jìn)一

3、步研究發(fā)現(xiàn)，該基因參與了大豆葉表皮角質(zhì)層的發(fā)育過(guò)程，并進(jìn)一步影響了突變體應(yīng)對(duì)干旱以及病原菌脅迫。所以該基因?qū)ξ磥?lái)培育抗旱以及抗病菌的大豆新品種具有重要的意義。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下：
　　1.大豆品種之間分子標(biāo)記的篩選
　　1）大豆擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）的設(shè)計(jì)以及多態(tài)性的篩選
　　對(duì)菏豆12，Williams82，吉林35進(jìn)行AFLP分析，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)這三個(gè)大豆品種利用27對(duì)不同的選擇性擴(kuò)增引物組合分別獲得625條，61

4、9條，622條條帶，三個(gè)品種兩兩之間共產(chǎn)生了410個(gè)差異片段，其中菏豆12與吉林35之間有138個(gè)差異性位點(diǎn)，菏豆12與Williams82之間有145個(gè)差異性位點(diǎn)，吉林35與Williams82之間有127個(gè)差異位點(diǎn)。
　　2）大豆SSR分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)與篩選
　　從BARCSOYSSR Potential SSRs中選取了98個(gè)潛在的具有SSR多態(tài)性的位點(diǎn)，對(duì)菏豆12，Williams82，吉林35進(jìn)行了SSR多態(tài)性分析。

5、結(jié)果表明：菏豆12與Williams82之間多態(tài)性位點(diǎn)有41個(gè)，占總數(shù)的42%；菏豆12與吉林35之間多態(tài)性位點(diǎn)26個(gè)，占總數(shù)的27%；吉林35與Williams82之間多態(tài)性位點(diǎn)16個(gè)，占總數(shù)的16%。菏豆12與Williams82之間SSR分子標(biāo)記設(shè)計(jì)成功率較高，反映出兩者之間的遺傳多樣性更高，使得兩者成為較合適的構(gòu)建群體組合。
　　3）大豆INDEL分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)以及篩選
　　本實(shí)驗(yàn)篩選了在染色體上均勻分布的248個(gè)I

6、NDEL位點(diǎn)以獲得足夠數(shù)量的錨定分子標(biāo)記。經(jīng)PCR驗(yàn)證確定共有169個(gè)分子標(biāo)記具有多態(tài)性，預(yù)測(cè)成功率為69%。169個(gè)INDEL分子標(biāo)記分布于所有二十條染色體中，其中分布最多的是Gm01染色體，共分布有24個(gè)，最少的也有4個(gè)，平均每條染色體上有8個(gè)。INDEL分子標(biāo)記的分布基本均勻，很少成簇出現(xiàn)，基本能夠滿足圖位克隆粗定位的要求。運(yùn)用這些分子標(biāo)記對(duì)其他12個(gè)大豆品種進(jìn)行多態(tài)性鑒定發(fā)現(xiàn)：這些分子標(biāo)記在中國(guó)和美國(guó)品種之間有著良好的多態(tài)性。進(jìn)

7、一步分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：具有多態(tài)性的分子標(biāo)記中有77%PCR產(chǎn)物是單產(chǎn)物，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于假陽(yáng)性INDEL的41%，這可能表明位于具有同源序列的INDEL位點(diǎn)可信度較低。生物信息學(xué)分析得到近五萬(wàn)個(gè)INDEL位點(diǎn)當(dāng)中可能會(huì)有相當(dāng)一部分是不真實(shí)的，造成這個(gè)問(wèn)題的原因可能是重測(cè)序片段錯(cuò)誤地比對(duì)上了參考基因組相應(yīng)位置的同源序列，造成了一小段沒(méi)有比對(duì)上的片段被分析成為INDEL位點(diǎn)。
　　2.大豆皺葉突變體的鑒定
　　在菏豆12伽馬射線誘變突變

8、體庫(kù)中篩選出一個(gè)株系的皺葉突變體。皺葉突變體的第一三出復(fù)葉葉尖在種植18天之后開始?jí)乃?，?dǎo)致小葉遠(yuǎn)軸端無(wú)法伸長(zhǎng)，葉細(xì)胞在葉片發(fā)育過(guò)程中不斷堆積，形成皺葉的表型。在純化突變體遺傳背景過(guò)程中發(fā)現(xiàn)突變體與菏豆12野生型雜交F1代為野生型表型，F(xiàn)2代群體中突變體與野生型的比例為1：3，符合孟德?tīng)栠z傳定律，證明該突變位點(diǎn)為隱性單位點(diǎn)突變。
　　3.大豆皺葉突變體的圖位克隆
　　首先構(gòu)建了皺葉突變體與Williams82的雜交群體。在F

9、2代中選取突變體表型植株做圖位克隆。通過(guò)粗定位，將突變位點(diǎn)定位于7號(hào)染色體1.371Mb和2.417 Mb之間，但再繼續(xù)向內(nèi)設(shè)計(jì)分子標(biāo)記的時(shí)候發(fā)現(xiàn)一段區(qū)間內(nèi)擴(kuò)增不出條帶，故懷疑可能存在片段缺失。在缺失邊界附近設(shè)計(jì)Inverse PCR引物，最終確定缺失范圍是7號(hào)染色體2118557到2371744 bp。內(nèi)共包含有27個(gè)基因涉及脂肪酸代謝，甘油代謝，生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)认嚓P(guān)功能。
　　4.突變基因的確定
　　隨后又在Willia

10、ms82伽馬射線誘變，EMS誘變突變體庫(kù)中篩選到表型一致的突變體株系4個(gè)，編號(hào)分別為：MSN7442，SC5591，SC5962，SC7321。菏豆12與MSN7442雜交后發(fā)現(xiàn)F1代為突變體表型，證明兩個(gè)株系的突變位點(diǎn)是等位關(guān)系。提取MSN7442株系突變體的基因組DNA，將菏豆12突變體缺失的27個(gè)基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在Glyma.07G028600（Soybase v1.1版本的該基因編號(hào)為Glyma07g03230）基

11、因外顯子出存在G到T的堿基顛換，導(dǎo)致編碼的氨基酸由天冬氨酸變?yōu)槔野彼?。?duì)其余三個(gè)株系的Glyma.07G028600基因PCR擴(kuò)增并測(cè)序之后發(fā)現(xiàn)：SC7321在外顯子處缺失TCTTTTATCC十個(gè)堿基并加入A；SC5591在第三個(gè)外顯子前2個(gè)堿基的內(nèi)含子處存在一個(gè)由A到T的堿基顛換，推測(cè)可能導(dǎo)致了mRNA的錯(cuò)誤剪切；SC5962在外顯子處有一個(gè)G到A的堿基替換，導(dǎo)致編碼的氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼?。綜上測(cè)序的結(jié)果表明：這四個(gè)株系的突變體在

12、Glyma.07G028600基因上存在非同義突變，并且菏豆12皺葉突變與MSN7442為等位突變體。構(gòu)建Glyma.07G028600過(guò)表載體，并遺傳轉(zhuǎn)化MSN7442，突變體表型恢復(fù)為野生型。以上實(shí)驗(yàn)證明Glyma.07G028600基因的突變?cè)斐闪税櫲~的表型。
　　5.Glyma.07G028600基因的表達(dá)模式
　　Glyma.07G028600基因編碼甘油三磷酸激酶，其在擬南芥中的直系同源基因是NHO1/GLI1。

13、擬南芥nho1突變體的非寄主性抗性降低導(dǎo)致突變體對(duì)病原菌的侵染不耐受。大豆Glyma.07G028600基因在全身各組織器官中均有表達(dá)，其中果莢中的表達(dá)豐度最高，葉片次之。構(gòu)建Glyma.07G028600融合eGFP過(guò)表載體，轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，結(jié)果表明融合蛋白主要定位于細(xì)胞膜上。莖尖原位雜交的結(jié)果表明該基因在大豆莖尖分生組織，葉原基等處均有表達(dá)。
　　6.Glyma.07G028600基因的功能分析
　　菏豆12背景的皺

14、葉突變體較其野生型，Williams82背景下的4個(gè)株系的皺葉突變體較其野生型的離體葉片失水速率均快一倍以上。由此推測(cè)突變體葉表皮的角質(zhì)層可能存在問(wèn)題。掃描電鏡結(jié)果顯示：突變體葉表面的蠟質(zhì)晶體堆積不正常。突變體及野生型葉片橫切切片的透射電鏡結(jié)果表明：突變體的表皮層變?。徽娼琴|(zhì)層親鋨性降低，表明突變體角質(zhì)的密度變低。對(duì)突變體及野生型表層蠟質(zhì)進(jìn)行的質(zhì)譜分析表明：突變體和野生型的蠟質(zhì)總量沒(méi)有顯著區(qū)別，但不同成分含量差別很大。突變體和野生型接種

15、大豆細(xì)菌斑點(diǎn)病菌4天后，突變體葉子內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量是野生型的6倍多，證明突變體應(yīng)對(duì)病原菌侵染的能力變低。
　　7.角質(zhì)層發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)豐度受Glyma.07G028600基因影響
　　結(jié)合掃描電鏡，透射電鏡，以及蠟質(zhì)成分質(zhì)譜分析的結(jié)果，對(duì)涉及植物蠟質(zhì)，角質(zhì)合成，轉(zhuǎn)運(yùn)，組裝，調(diào)控的20多個(gè)基因在野生型和突變體葉片中的表達(dá)豐度進(jìn)行了分析，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)豐度差異不顯著。角質(zhì)合成酶基因（GmLTL1）等合成相關(guān)基因在野生

16、型和突變體中表達(dá)豐度差異很大，一些轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)豐度差異也很大。推測(cè)Glyma.07G028600基因?qū)χ参锝琴|(zhì)層的發(fā)育起著重要的作用。
　　本論文的主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)：
　　1.開發(fā)了一定數(shù)量的INDEL分子標(biāo)記，這些標(biāo)記在其他大豆品種之間也具有較好的多態(tài)性。生物信息學(xué)比對(duì)得到的近五萬(wàn)個(gè)INDEL位點(diǎn)能夠?yàn)榇蠖惯z傳以及分子輔助育種提供豐富的信息。這些數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至Soybase，并填補(bǔ)了大豆公共數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有INDEL分子標(biāo)記的空白。