家蠶新突變體4齡幼蟲致死基因的定位克隆及功能研究.pdf

1、家蠶是一種完全變態(tài)昆蟲，幼蟲期是其整個(gè)生活史中生長(zhǎng)發(fā)育和儲(chǔ)存能量的重要階段，因此幼蟲期致死對(duì)家蠶生命周期的影響無疑是巨大的，同時(shí)也會(huì)對(duì)養(yǎng)蠶生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。4齡幼蟲致死突變（lethal mutant in the fourth instar larvae，l-4i）是一種新的幼蟲期致死的突變體，本研究在對(duì)l-4i突變體遺傳分析的基礎(chǔ)上，采用圖位克隆技術(shù)對(duì)l-4i的突變基因進(jìn)行了定位克隆，構(gòu)建了遺傳連鎖圖，采用qRT-PCR、RN

2、Ai、酶活測(cè)定和添食特異性抑制劑方法對(duì)突變基因進(jìn)行表達(dá)分析和功能驗(yàn)證，證實(shí)了家蠶拓?fù)洚悩?gòu)酶基因Bmtop的突變是導(dǎo)致l-4i突變體的主要原因，為進(jìn)一步研究l-4i突變體致死的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。主要研究成果如下：
　　一、l-4i突變體的表型特征與遺傳分析
　　4齡幼蟲致死突變（lethal mutant in the fourth instar larvae，l-4i）是在對(duì)家蠶品種P33的飼養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)的一種新的幼蟲期致

3、死型突變體，其特征為l-4i突變體幼蟲在3齡第2天就表現(xiàn)出體型較正常個(gè)體小，活力較差，生長(zhǎng)發(fā)育緩慢的特征，3齡期延長(zhǎng)約2天，4齡起蠶后極少進(jìn)食，生長(zhǎng)發(fā)育基本停滯，并于4齡第3~4天陸續(xù)死亡。遺傳分析初步判斷該突變體由常染色體上的一個(gè)隱性遺傳基因控制，且為同質(zhì)型（l-4il-4i）致死。
　　二、l-4i突變基因的連鎖及定位分析
　　根據(jù)l-4i突變體的遺傳規(guī)律可以得出該突變性狀是由隱性純合基因控制的，由于l-4i/l-4i有

4、致死性，我們采用基因型為+/l-4i的雄蛾親本（P2）與C108的雌性親本（P1）雜交，通過一雄交二雌的方法組配并篩選雜合型F1代群體；篩選出的F1代個(gè)體進(jìn)行自交或與4齡幼蟲致死突變體系統(tǒng)中有性狀分離的蛾區(qū)的親本進(jìn)行正反交回交分別組配F2代，BC1F和BC1M群體。然后用P1、F1和P2篩選了家蠶28個(gè)連鎖群上具有多態(tài)性的SSR分子標(biāo)記；用約400個(gè)BC1F、BC1M和F2代群體確定l-4i突變基因所在的連鎖群并進(jìn)行精細(xì)定位。連鎖分析結(jié)

5、果顯示l-4i的突變基因位于家蠶第17連鎖群；定位結(jié)果顯示突變基因位于S2865-204和S2865-148兩個(gè)多態(tài)性標(biāo)記之間，相距約320kb，包含有18個(gè)候選基因。
　　三、l-4i突變基因的鑒定
　　采用RT-PCR方法對(duì)位于目標(biāo)區(qū)域內(nèi)候選基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測(cè)但沒有找到有明顯表達(dá)差異的基因，繼而又對(duì)區(qū)域內(nèi)18個(gè)基因的ORF采取克隆測(cè)序以期查找差異基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分基因的ORF沒有差異，只有BMgn007081基因

6、的ORF在突變體l-4i中存在兩處缺失：在1430-1477位置處缺失48個(gè)堿基，在2566位置發(fā)生單堿基缺失。
　　RNAi初步對(duì)BMgn007081基因進(jìn)行功能驗(yàn)證，結(jié)果顯示干擾該基因后家蠶出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢，食桑少，蠶體較小，活力較差的表型，進(jìn)入眠期的時(shí)間比對(duì)照組晚約24小時(shí)左右，且后期有的家蠶幼蟲陸續(xù)開始死亡，這與l-4i突變體的表型類似，因此初步判斷BMgn007081基因突變是導(dǎo)致l-4i突變體的主要原因。
　　利用熒

7、光定量PCR對(duì)BMgn007081基因即家蠶拓?fù)洚悩?gòu)酶基因（Bmtop）在家蠶不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了檢測(cè)，獲得了該基因的組織表達(dá)譜和齡期表達(dá)圖譜，發(fā)現(xiàn)該基因在家蠶體內(nèi)幾乎所有組織和發(fā)育時(shí)期都有表達(dá)，這說明該基因是家蠶體內(nèi)的重要功能基因，這也從側(cè)面為突變基因的鑒定提供了有力證據(jù)。
　　四、l-4i突變基因的功能驗(yàn)證
　　家蠶基因組數(shù)據(jù)庫中對(duì)BMgn007081基因的注釋為該基因編碼一種家蠶拓?fù)洚悩?gòu)酶III，屬于

8、拓?fù)洚悩?gòu)酶IA家族。為了進(jìn)一步驗(yàn)證該突變基因的功能，通過對(duì)野生型家蠶在不同發(fā)育齡期添食40 mg/kg、80 mg/kg和160 mg/kg濃度的拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑喜樹堿（Camptothecin，CPT），觀察家蠶生長(zhǎng)發(fā)育狀況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，添食喜樹堿后家蠶表現(xiàn)出生長(zhǎng)遲緩，蠶體較小，且后期開始陸續(xù)死亡，這與l-4i突變體的自然突變表型非常一致。
　　此外我們考察拓?fù)洚悩?gòu)酶在野生型家蠶和l-4i突變體體內(nèi)的酶活力差異，同時(shí)也了檢測(cè)

9、添食不同濃度CPT的家蠶體內(nèi)酶活力的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，l-4i突變體中拓?fù)洚悩?gòu)酶活性遠(yuǎn)低于野生型家蠶，添食CPT家蠶體內(nèi)的酶活力也低于對(duì)照組家蠶，且隨著CPT濃度的增加家蠶體內(nèi)拓?fù)洚悩?gòu)酶酶活力呈現(xiàn)出遞減的趨勢(shì)。綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定家蠶l-4i突變體體內(nèi)的拓?fù)洚悩?gòu)酶編碼區(qū)缺失而導(dǎo)致酶活力降低是導(dǎo)致l-4i突變體發(fā)生并死亡的主要原因。
　　上述研究證實(shí)了家蠶拓?fù)洚悩?gòu)酶基因Bmtop的突變是導(dǎo)致l-4i突變體產(chǎn)生的主要原因，該研究