小鼠內(nèi)皮抑素基因突變體的克隆表達及功能的初步研究.pdf

1、大連醫(yī)科大學碩士學位論文小鼠內(nèi)皮抑素基因突變體的克隆表達及功能的初步研究姓名：黃曉華申請學位級別：碩士專業(yè)：臨床檢驗診斷學指導教師：左云飛20050601p B V 2 2 0 ．E M 7 與p B V 2 2 0 ．E n d o s t a t i n 轉(zhuǎn)入大腸桿菌D H 5 a 中，初步分離純化表達蛋白并進行體外活性實驗檢測改性后內(nèi)皮抑素的活性，通過與全長內(nèi)皮抑素的比較研究去除c 末端的氨基酸是否會影響內(nèi)皮抑素的抗血管活性。為此

2、作了以下工作：1 ．以本教研室保存的質(zhì)粒表達載體p B V 2 2 0 ．E n d o s t a t i n 為模板，設(shè)計合成的一對分別帶有B a m H I 和E c o R I 的限制性內(nèi)切酶識別位點的特異性引物，P C R 法擴增E M 7 基因片段并引入上述兩個酶切位點。2 ．用B a m HI 和E c o R I 酶切P C R 產(chǎn)物及p B V 2 2 0 ，將目的基因插入質(zhì)粒p B V 2 2 0 中，構(gòu)建重組質(zhì)粒p

3、 B V 2 2 0 ．E M 7 ，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌D H 5 a 中并篩選陽性克隆，用雙脫氧末端終止法測序，結(jié)果表明與已知小鼠內(nèi)皮抑素C 末端去除2 1 個堿基的基因序列一致。3 。用溫度誘導重組質(zhì)粒p B V 2 2 0 ．E M 7 、p B V 2 2 0 ．E n d o s t a t i n 在宿主菌中表達外源蛋白。并用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測表達產(chǎn)物。4 ．將表達蛋白初步分離純化，并利用初步純化的蛋白進行雞胚絨毛

4、膜尿囊實驗( C A M ) 。結(jié)果表明重組質(zhì)粒p B V 2 2 0 ．E M 7 、p B V 2 2 0 ．E n d o s t a t i n 在宿主菌中表達的外源蛋白均可在C A M 實驗中抑制新血管的生成。本實驗成功克隆了E M 7 基因，構(gòu)建了重組質(zhì)粒p B V 2 2 0 ．E M 7 ，并將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌D H 5 a 中。誘導改性后內(nèi)皮抑索及完整的內(nèi)皮抑素蛋白的表達，并對表達的蛋白進行初步純化。通過C A M