17位絲氨酸突變體干擾素β融合基因的克隆、構(gòu)建、表達(dá)及純化.pdf

1、目的:該實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹痪褪强寺?7位為Ser的人干擾素β突變體基因,同時(shí)保留了未突變的HuIFN-β基因,以便于比較.該實(shí)驗(yàn)?zāi)康闹褪窃诋叧嘟湍钢袠?gòu)建表達(dá)IFN-β基因,為基因工程人IFN-β的生產(chǎn)探索一種新方法.由于在畢赤酵母中表達(dá)的蛋白可能會(huì)出現(xiàn)N末端不均一現(xiàn)象,我們在表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建設(shè)計(jì)時(shí)采取了兩種方法:第一,直接將目的基因插在信號(hào)肽pro序列中的Lys-Arg后面,刪除了Glu-Ala-Glu-Ala重復(fù)序列,這樣就不會(huì)造成這四個(gè)多

2、余氨基酸在N末端殘留;第二,我們設(shè)計(jì)了兩個(gè)融合蛋白,將6個(gè)組氨酸編碼(His·Tag)、FactorXa酶切位點(diǎn)編碼和β干擾素基因順序插入Glu-Ala-Glu-Ala重復(fù)序列后的EcoRI位點(diǎn).這樣,既能簡便快捷的用金屬鰲合親和填料純化表達(dá)產(chǎn)物,又能通過Factor Xa高效完全切除可能出現(xiàn)的N末端多余氨基酸和HisTag,得到目的蛋白,提高蛋白的利用率,這也是該研究目的之三.方法與結(jié)果:1.人干擾素β、17絲氨酸突變干擾素β基因及兩

3、者融合基因的克隆與構(gòu)建.2.四種干擾素β重組質(zhì)粒在畢赤酵母中的轉(zhuǎn)染和表達(dá).3.17位絲氨酸突變體干擾素β融合蛋白的發(fā)酵、純化及產(chǎn)物分析.結(jié)論:1.該研究成功構(gòu)建了四個(gè)干擾素β基因,并首次成功實(shí)現(xiàn)了17位Ser突變?nèi)薎FN-β在巴斯德畢赤酵母中表達(dá).由于17位Ser突變能提高IFN-β穩(wěn)定性,對生產(chǎn)過程和臨床應(yīng)用十分有意義.2.首次設(shè)計(jì)在17位Ser突變HuIFN-β蛋白和α因子信號(hào)肽之間融合了6個(gè)組氨酸(His·Tag)和Factor

4、Xa酶切位點(diǎn).這樣,既能簡便快捷的用金屬鰲合親和填料純化表達(dá)產(chǎn)物,又能通過Factor Xa高效完全切除可能出現(xiàn)的N末端多余氨基酸和HisTag,得到目的蛋白,提高蛋白的利用率.3.實(shí)驗(yàn)中構(gòu)建篩選了Mut<'+>表型的畢赤酵母GSll5表達(dá)菌株,可實(shí)現(xiàn)短時(shí)間、高密度發(fā)酵表達(dá),比文獻(xiàn)報(bào)道的同類研究結(jié)果縮短了2-3天時(shí)間,這對工業(yè)生產(chǎn)是十分有意義的.4.實(shí)驗(yàn)對<'17>Ser-FuIFN-β發(fā)酵、純化工藝進(jìn)行了研究,為基因工程人IFN-β的