豬干擾素-γ基因的克隆及其表達(dá).pdf

1、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文豬干擾素γ基因的克隆及其表達(dá)姓名：陳幸德申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：楊國(guó)慶陳永福20030701中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要豬干擾素一Y基因的克隆及其表達(dá)中文摘要從豬的肝臟組織中提取基因組DNA，用長(zhǎng)鏈PCR的方法擴(kuò)增得到豬的干擾素一Y基因，經(jīng)測(cè)序表明其與GenBank中發(fā)表的豬干擾素一Y基因序列的同源性為99％左右。將其純化后克隆到真核表達(dá)載體PCI—neo載體中組裝成了真核表達(dá)載

2、體PCI—neo—PolFNY。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組載體PCI—rleo—PoIFNY轉(zhuǎn)染入倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO)中，在G418的存在下進(jìn)行篩選培養(yǎng)。獲得了能表達(dá)豬干擾素一Y的轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞。用UNIQ10柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取總RNA。并通過(guò)RTPCR的方法擴(kuò)增獲得豬干擾素一YcDNA基因，這也從另一途徑證實(shí)了豬干擾素一Y基因已成功地整合到細(xì)胞染色體中并能正確的轉(zhuǎn)錄出其mRNA。將獲得的豬干擾素一ycDNA

3、基因克隆入原核表達(dá)載體pBV220中，組裝成了原核表達(dá)載體pBV220cPolFNY，經(jīng)正反測(cè)序表明其與GenBank中發(fā)表的豬干擾素一YeDNA序列完全相同將這個(gè)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達(dá)菌株D晦口和BL21中。溫度誘導(dǎo)培養(yǎng)后，經(jīng)SDS—PAGE和Western實(shí)驗(yàn)檢測(cè)可知特異表達(dá)帶約在17KD的位置，井證實(shí)在菌株DH5Ⅱ和BL21中的表達(dá)量沒(méi)有明顯的差異。其表達(dá)量都約占細(xì)菌總蛋白的15％左右。關(guān)鍵詞：豬干擾素一Y，真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染