犬β干擾素的基因克隆、原核表達(dá)及活性測定.pdf

1、隨著社會進(jìn)步和人民生活方式的改變，犬作為伴侶動物已成為人們生活的一部分。犬細(xì)小病毒病、犬瘟熱、犬腺病毒感染病毒病嚴(yán)重危害養(yǎng)犬業(yè)的發(fā)展，目前無有效的治療藥物，主要用疫苗接種進(jìn)行預(yù)防，但免疫效果欠佳。β干擾素(Interferno-β，IFN-β)等干擾素是由動物細(xì)胞產(chǎn)生的一類分泌型糖蛋白，具有廣譜抗病毒和增強(qiáng)免疫作用，可用于犬病毒病的治療。目前臨床上使用的主要是重組大腸桿菌表達(dá)的α干擾素，不僅抗病毒譜受到一定限制，而且純化過程復(fù)雜，生產(chǎn)成

2、本較高。為了增強(qiáng)干擾素對犬病毒病的治療效果和降低生產(chǎn)成本，本研究將彈性蛋白樣多肽(Elastin-like polypeptide，ELP)-蛋白內(nèi)含肽(intein)介導(dǎo)的新型大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，用于犬β干擾素的表達(dá)與純化，現(xiàn)將研究結(jié)果報告如下：
　　 ⑴從比格犬耳皮膚組織中提取基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增出犬β干擾素成熟肽編碼序列，將擴(kuò)增產(chǎn)物克隆于質(zhì)粒載體并進(jìn)行測序，結(jié)果顯示與GeneBnak上公布的犬β干擾素基因同源性

3、為100％。
　　 ⑵將β干擾素成熟肽編碼序列克隆入含ELP與intein融合基因的pET-MIE原核表達(dá)載體，將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌，用溫敏誘導(dǎo)法誘導(dǎo)重組菌表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析證明，表達(dá)的重組β干擾素以可溶性形式存在，分子量為預(yù)期大小相符。
　　 ⑶利用ELP的溫度敏感可逆相變特性，將重組菌的超聲波裂解物在不同的溫度下進(jìn)行反復(fù)離心，獲得純化的ELP-intein-IFN-β融合蛋白；再利用intein的自動