牛干擾素-tau的原核表達(dá)及生物活性鑒定.pdf

1、IFN-τ是反芻動(dòng)物妊娠后胚胎向母體發(fā)出的最初妊娠信號(hào)，在母體妊娠識(shí)別過(guò)程中起著重要的作用。本試驗(yàn)以牛體內(nèi)胚胎為材料，通過(guò)一步法PCR從胚胎基因組中擴(kuò)增牛IFN-τ基因(含信號(hào)肽)，擴(kuò)增產(chǎn)物與中間載體pGEM-T Vector連接，經(jīng)過(guò)酶切和。DNA測(cè)序鑒定后，通過(guò)定向克隆分別將含信號(hào)肽和不含信號(hào)肽的牛IFN-τ基因與原核表達(dá)載體pET-30a(+)連接，并分別命名為pET-blFNS(+)-τ和pET-bIFNS(-)-τ,采剛IPT

2、G進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，采用10M尿素溶解包涵體，通過(guò)Ni<'2+>親合層析進(jìn)行純化，通過(guò)抗病毒活性檢測(cè)和對(duì)牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的影響兩個(gè)方面鑒定rblFN-τ的生物活性。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)一步法 PCR擴(kuò)增得到的牛IFN-τ(含信號(hào)肽)基因與已知序列(XM593584)比對(duì)后，核苷酸和氨基酸序列的同源性分別達(dá)99％和97％，證明成功克隆了牛IFN-τ基因(含信號(hào)肽)。在25℃和37℃條件下，采用0.1mM IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，SDS-P

3、AGE電泳檢測(cè)，含有信號(hào)肽的pET-bIFNS(+).-τ質(zhì)粒與誘導(dǎo)前和空載體相比，誘導(dǎo)后，在約20kD處均無(wú)特異性蛋白條帶產(chǎn)生，而不含信號(hào)肽的pET-bIFNS(-)-τ質(zhì)粒誘導(dǎo)后與對(duì)照相比，在約20kD處均有特異性條帶產(chǎn)生，證明不含信號(hào)肽的牛IFN-τ基因可以在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并且表達(dá)量高。牛IFN-τ在誘導(dǎo)表達(dá)過(guò)程中，形成了不溶性的包涵體，經(jīng)過(guò)10M尿素溶解后，部分rbIFN-τ從沉淀中轉(zhuǎn)移至上清中，在活性條件下，純化得到了純