天府肉鴨α干擾素的原核表達(dá)及抗病毒活性研究.pdf

1、本文對(duì)天府肉鴨的干擾素進(jìn)行如下系列研究：對(duì)天府肉鴨Ⅰ型干擾素基因IFN-αORF進(jìn)行克隆、鑒定和序列分析；構(gòu)建IFN-αORF基因原核表達(dá)載體；IFN-α原核表達(dá)及其生物學(xué)活性研究；利用DEF-VSV系統(tǒng)，對(duì)稀釋復(fù)性后的天府肉鴨IFN-α成熟蛋白抗病毒活性進(jìn)行了研究，獲得以下結(jié)果：
　　 1.天府肉鴨IFN-αORF基因克隆、序列比對(duì)分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)
　　 應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計(jì)了兩對(duì)加入EcoRI和HindⅢ兩

2、個(gè)酶切位點(diǎn)的特異性引物，從經(jīng)過5μg/mlPHA誘導(dǎo)培養(yǎng)的天府肉鴨外周血單核細(xì)胞中提取RNA，采用RT-PCR的方法，擴(kuò)增得到天府肉鴨α干擾素ORF基因的DNA片段。構(gòu)建了pMD18-T-DuIFNα克隆載體并測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果采用DNAStar7.0軟件進(jìn)行序列分析以及與鴨、雞、鵝等GenBank上α干擾素序列進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示天府肉鴨與鴨(X84764)ORF基因序列十分相似，其核苷酸同源性達(dá)到99.5％，氨基酸同源性為98.4％。

3、與鵝(AY524422)核苷酸及氨基酸同源性分別為96.2％，92.15％；與雞(NM_205427)的核苷酸及氨基酸同源性分別為73.4％、51.3％。同時(shí)對(duì)該基因所推測(cè)的蛋白進(jìn)行了分析，結(jié)果表明天府肉鴨干擾素有2個(gè)潛在糖基化位點(diǎn)，8個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，信號(hào)肽切割位點(diǎn)28-29位ANA和FS氨基酸之間，存在跨膜區(qū)。
　　 2.天府肉鴨IFN-α成熟蛋白基因的克隆、原核表達(dá)及多克隆抗體的制備
　　 構(gòu)建天府肉鴨IFN-α

4、成熟蛋白基因的重組原核表達(dá)載體pET-32a(+)-mDuIFNα，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS表達(dá)菌株，利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到大小約為35kDa的重組融合蛋白，與預(yù)期表達(dá)的蛋白大小相一致，主要以包涵體的形式存在。最佳表達(dá)優(yōu)化條件為0.2mmol/L的IPTG，37℃下誘導(dǎo)3～4h。利用純化的重組蛋白制各兔抗高免血清，瓊脂糖擴(kuò)散試驗(yàn)效價(jià)為1：32。兔抗鴨IFN-α成熟蛋白IgG經(jīng)硫酸銨鹽析和High-Q陰離子交