天府肉鴨α干擾素的原核表達及抗病毒活性研究.pdf

1、本文對天府肉鴨的干擾素進行如下系列研究：對天府肉鴨Ⅰ型干擾素基因IFN-αORF進行克隆、鑒定和序列分析；構(gòu)建IFN-αORF基因原核表達載體；IFN-α原核表達及其生物學活性研究；利用DEF-VSV系統(tǒng)，對稀釋復性后的天府肉鴨IFN-α成熟蛋白抗病毒活性進行了研究，獲得以下結(jié)果：
　　 1.天府肉鴨IFN-αORF基因克隆、序列比對分析和蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測
　　 應(yīng)用Oligo6.0軟件設(shè)計了兩對加入EcoRI和HindⅢ兩

2、個酶切位點的特異性引物，從經(jīng)過5μg/mlPHA誘導培養(yǎng)的天府肉鴨外周血單核細胞中提取RNA，采用RT-PCR的方法，擴增得到天府肉鴨α干擾素ORF基因的DNA片段。構(gòu)建了pMD18-T-DuIFNα克隆載體并測序，對測序結(jié)果采用DNAStar7.0軟件進行序列分析以及與鴨、雞、鵝等GenBank上α干擾素序列進行了比較。結(jié)果顯示天府肉鴨與鴨(X84764)ORF基因序列十分相似，其核苷酸同源性達到99.5％，氨基酸同源性為98.4％。

3、與鵝(AY524422)核苷酸及氨基酸同源性分別為96.2％，92.15％；與雞(NM_205427)的核苷酸及氨基酸同源性分別為73.4％、51.3％。同時對該基因所推測的蛋白進行了分析，結(jié)果表明天府肉鴨干擾素有2個潛在糖基化位點，8個潛在的磷酸化位點，信號肽切割位點28-29位ANA和FS氨基酸之間，存在跨膜區(qū)。
　　 2.天府肉鴨IFN-α成熟蛋白基因的克隆、原核表達及多克隆抗體的制備
　　 構(gòu)建天府肉鴨IFN-α

4、成熟蛋白基因的重組原核表達載體pET-32a(+)-mDuIFNα，將其轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS表達菌株，利用IPTG進行誘導表達，得到大小約為35kDa的重組融合蛋白，與預(yù)期表達的蛋白大小相一致，主要以包涵體的形式存在。最佳表達優(yōu)化條件為0.2mmol/L的IPTG，37℃下誘導3～4h。利用純化的重組蛋白制各兔抗高免血清，瓊脂糖擴散試驗效價為1：32。兔抗鴨IFN-α成熟蛋白IgG經(jīng)硫酸銨鹽析和High-Q陰離子交