丹頂鶴α干擾素的克隆、表達及抗病毒活性分析.pdf

1、學(xué)校代碼：10225學(xué)號：S15517學(xué)位論文丹頂鶴僅干擾素的克隆、表達及抗病毒活性分析指導(dǎo)教師姓名：申請學(xué)位級別：論文提交日期：授予學(xué)位單位：邢明偉碩士田荔東北林業(yè)大學(xué)2015年4月東北林業(yè)大學(xué)學(xué)科專業(yè)：論文答辯日期：授予學(xué)位日期：答辯委員會主席：馬建章論文評閱人：東多器櫛素大學(xué)日C、月月66學(xué)年年里55生加如摘要摘要0【干擾素(InterferonOc，IFN—oc)是機體白細胞產(chǎn)生的一種細胞因子，具有抗病毒繁殖、抗腫瘤生長和免疫調(diào)

2、節(jié)等多種生物學(xué)功能，是機體防御系統(tǒng)的重要組成部分。近些年來，動物干擾素的研究主要集中于經(jīng)濟動物，并取得了一定進展，目前已有商品化的雞、犬、豬重組干擾素產(chǎn)品在市場上應(yīng)用。迄今為止，國內(nèi)外尚未有關(guān)于丹頂鶴(Grus，aponensis)干擾素方面的相關(guān)報道。丹頂鶴是大型涉禽，在濕地環(huán)境中屬于食物鏈的上層，是濕地生物多樣性的關(guān)鍵物種，被稱為“濕地之神”。我國是世界上丹頂鶴棲息的主要國家，國家林業(yè)局已經(jīng)把丹頂鶴作為唯一的國鳥候選鳥上報國務(wù)院，是

3、國家一級保護動物。近年來，由于環(huán)境變遷和人為干擾，禽流感、新城疫、馬立克氏疾病時常暴發(fā)，野生丹頂鶴數(shù)量逐年下降，全球現(xiàn)存數(shù)量僅為2600只左右，而東亞的大陸種僅1500只左右。本研究利用簡并引物和基因組步移PCR技術(shù)首次克隆出丹頂鶴0【干擾素(crlFNⅡ)基因，該基因全長741bp，編碼246個氨基酸，與哺乳動物IFNcc的同源性小于45％，與禽IFN旺基因的同源性在60一80％之間，其巾與鸚鵡的親緣關(guān)系最近，同源性高達807％。根據(jù)

4、表達載體的酶切位點設(shè)計crlFNQ成熟肽基因表達引物，目的基因亞克隆到原核表達載體pET32a()r1，在大腸桿菌BL21巾進行表達。經(jīng)SDSPAGE電泳分析，crlFNQ的融合蛋白主要以包涵體的形式存在，大小約43KDa。該包涵體經(jīng)純化、透析復(fù)性處理后加到雞胚成纖維細胞上，而后進行水泡性臼炎病毒(VSV)攻擊，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組crlFNq可以抑制水泡性U炎病毒的復(fù)制，生物活性最高時達到187x10sU／rag；被兔抗crlFN僅多克降抗體

5、rfl和后的重組crlFN一0【將不再具備抗病毒功能。間接免疫熒光結(jié)果表明，crlFN—O【基因也可在雞胚成纖維細胞的細胞質(zhì)巾得到表達。此外，我們在克隆crIFN僅的過程中曾設(shè)計了2對簡并引物(AIF—TYla和AIFTY2b，POAU和AIF—TY2b)，其應(yīng)用結(jié)果表明，AIFTYla和AIFTY2b在擴增禽IFNc【時更為特異，為克降禽O【干擾素未知序列提供了重要參考。通過木研究，我們首次獲得了crlFN—Gc基因，在大腸桿菌和雞胚