重組雞α干擾素結(jié)構(gòu)與功能及其抗病毒活性的研究.pdf

1、中國是最大的養(yǎng)禽國，然而病毒病的流行一直困擾著養(yǎng)禽業(yè)，給養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前一些禽類病毒性疾病仍然缺乏有效的治療手段，化學(xué)藥物的使用易造成耐藥性，且容易引起動物體內(nèi)藥物殘留而影響人類健康，疫苗的研制則須考慮病毒變異和多樣性。因此，急需研制出安全、高效、新型的抗病毒制劑和免疫增強(qiáng)劑用于增強(qiáng)雞體的抵抗力和提高現(xiàn)有疫苗的保護(hù)率。干擾素是一類動物機(jī)體產(chǎn)生的多功能蛋白，它可由病毒感染而自發(fā)產(chǎn)生并隨血液循環(huán)至全身，激活細(xì)胞內(nèi)抗病毒作用機(jī)

2、制合成各種抗病毒蛋白以抵抗病毒的侵?jǐn)_。由于它高效的廣譜抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)活性以及其無可替代的臨床應(yīng)用價(jià)值，從人類發(fā)現(xiàn)干擾素開始，就從未停止過對它的探索研究。近年來，各種動物干擾素的研究取得了突破性進(jìn)展，在體外干擾素既可以單獨(dú)應(yīng)用于疾病的防治，又可以與疫苗聯(lián)合應(yīng)用，增強(qiáng)和改善疫苗的免疫效果，尤其是α干擾素在抗病毒感染等方面顯出良好的效果。近年來，雞干擾素（chicken interferon，ChIFN）的抗病毒和疫苗佐劑功能也在更多的

3、試驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)和證實(shí)。本研究的目的就是應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)研制出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的重組雞α干擾素并研究其抗病毒功能和對疫苗的免疫增強(qiáng)作用，為我國重組雞干擾素的工程化生產(chǎn)及其在養(yǎng)雞業(yè)中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究主要從以下幾個方面展開：
　　 1、雞α干擾素是一個多基因家族，具有20多種亞型，不同亞型間的生物學(xué)活性也有差異。利用DNAStar分子生物學(xué)軟件，對不同品種雞α干擾素不同亞型的基因序列進(jìn)行比較分析，篩選出同源性較高的基因序

4、列，并根據(jù)畢赤酵母的偏嗜性，換用畢赤酵母的優(yōu)勢密碼子，改變其成熟蛋白基因堿基序列，設(shè)計(jì)出一條新的雞α干擾素堿基序列，共507bp，利用primerpremier5.0分子生物學(xué)軟件，將該堿基序列設(shè)計(jì)成14條基因片段，相鄰兩條引物之間相互重疊15-22bp，SOE方法拼接該目的基因，將拼接好的該基因序列，連接到酵母表達(dá)載體pPICZα-A，構(gòu)建表達(dá)載體為pPICZα-A-ChIFN-α。pPICZα-A-ChIFN-α經(jīng)SacⅠ酶切線性化

5、后電轉(zhuǎn)化導(dǎo)入畢赤酵母菌株X-33。轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR分析鑒定后利用甘油增菌和甲醇誘導(dǎo)。SDS-PAGE蛋白電泳顯示，pPICZα-A-ChIFN-α在畢赤酵母系統(tǒng)中進(jìn)行了分泌表達(dá)，蛋白含量約為0.143mg·mL-1。經(jīng)VSV-CEF活性測定系統(tǒng)，測定其抗病毒活性約為1.76×106U·mL-1，比活性為1.23×107U·mg-1。本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了非天然干擾素在畢赤酵母中的成功表達(dá)，并具有較高的表達(dá)量和抗病毒活性。
　　 2、在人類干

6、擾素，利用點(diǎn)突變成功研究了個別氨基酸的改變引起其生物學(xué)功能發(fā)生變化，以此來研究出干擾素的基因結(jié)構(gòu)與其功能的相互關(guān)系，在此基礎(chǔ)上，我們通過對比雞、人干擾素的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其C端有較高的同源性。依據(jù)人類IFN-α點(diǎn)突變方式，我們對雞的IFN-α進(jìn)行了點(diǎn)突變，設(shè)計(jì)了五個突變體，分別為突變體Mut1：V141I，R142S，A145Y；突變體Mut2：V141L，R142S，A145Y；突變體Mut3：W138H，V141I，R142S，，A

7、145Y，W148S，L150S；突變體Mut4：L114S；突變體Mut5：L114S，W138H，V141I，R142S，A145Y，W148S，L150S；每個突變體分別設(shè)計(jì)14條基因片段，利用SOE拼接擴(kuò)增而成，構(gòu)建酵母表達(dá)系統(tǒng)并進(jìn)行了成功表達(dá)，蛋白量在表達(dá)水平上沒有顯著差異。用VSV-CEF系統(tǒng)測定其活性，與未經(jīng)改造的干擾素進(jìn)行比較：五個突變體活性差異較大，其中突變體Mut1和突變體Mut2活性較高，較未突變的干擾素活性分別提

8、高了28倍和15倍；突變體Mut4活性和原來相近；突變體Mut3和突變體Mut5活性較低，較未突變干擾素相比分別下降了32倍和23倍。結(jié)合已證實(shí)和預(yù)測的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)：雞Ⅰ型α干擾素的受體結(jié)合部位位于第29-35位點(diǎn)氨基酸及第123-140位點(diǎn)氨基酸，IFN的C端對抗病毒、抗增殖活性有影響，氨基酸的突變有利于增強(qiáng)其組織親和力，提高其生物學(xué)活性。
　　 3、在雞胚成纖維細(xì)胞上研究了重組雞α干擾素對禽流感病毒（AⅣ）、新城疫病毒

9、（NDV）的抗病毒效果，結(jié)果表明：重組雞α干擾素可降低AⅣ在雞胚成纖維細(xì)胞上的增殖滴度，1000U/mL和100U/mL的重組α雞干擾素處理的雞胚成纖維細(xì)胞中AⅣ的滴度分別比對照降低2.76Log10TCID50和1.93Log10TCID50，高濃度的干擾素抑制作用更顯著；重組雞α干擾素對NDV在雞胚成纖維細(xì)胞中的抑制作用更為明顯，1000U/mL和100U/mL的重組α雞干擾素處理的雞胚成纖維細(xì)胞中強(qiáng)毒株的滴度分別比對照降低1.73

10、Log10TCID50和0.89Log10TCID50，1000U/mL的重組雞α干擾素可以完全抑制100TCID50/mL新城疫病毒在雞胚成纖維細(xì)胞上產(chǎn)生病變。
　　 4、使用重組雞α干擾素蛋白作為免疫佐劑，檢測雞α干擾素蛋白對禽流感病毒H9N2亞型滅活疫苗的免疫調(diào)節(jié)作用。將20日齡的海蘭白蛋雞，隨機(jī)分為6組，采用胸部肌肉注射方式進(jìn)行免疫，對照組僅接種H9N2亞型禽流感滅活疫苗，試驗(yàn)組分別同時(shí)接種H9N2亞型禽流感滅活疫苗0.