貓干擾素Omega基因的克隆、可溶性表達及抗病毒活性研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、貓omega型干擾素(FeIFN-ω)是一類具有廣譜抗病毒、抗腫瘤和免疫增強作用的細胞因子。本實驗首先從被病毒感染的死亡家貓脾臟中提取總RNA為模板,通過RT-PCR的方法克隆出家貓干擾素ω型基因,然后將所擴增出來的基因去除信號肽區(qū),只保留成熟蛋白區(qū)基因,重新設計含有BamHI和NheI酶切位點的一對特異性引物進行基因擴增,所得到的PCR產物純化回收后,經BamHI和NheI雙酶切,插入含有麥芽糖分泌結合蛋白(MBP)的pMBP-P表達

2、載體,并轉化大腸桿菌TOP10F'感受態(tài)細胞,用含氨芐青霉素(Amp)的LB平板,篩選陽性克隆,并對重組子進行BamHI和NheI雙酶切鑒定、PCR鑒定和測序鑒定。鑒定后的重組基因工程菌株,經IPTG誘導表達,SDS-PAGE電泳結果顯示目的蛋白以可溶形式在細胞周質空間中得以表達。隨后,采用Ni-NTA親和層析純化FeIFN-ω,再經SDS-PAGE電泳和WesternBlot檢測,分析純化的重組蛋白。最后采用貓腎上皮細胞(CRFK)-

3、濾泡性口炎病毒(VSV)系統(tǒng)按照細胞病變抑制法測定FeIFN-ω的抗病毒效價(TCID50)。 結果表明,本研究成功克隆了貓omega型干擾素基因,其全長591bp,編碼196個氨基酸序列,其中1-23位氨基酸為信號肽區(qū),24-196位氨基酸為成熟蛋白區(qū)。缺少信號肽的基因序列全長519bp,編碼173個氨基酸。所構建的質粒pMBP-P/FeIFN-ω在大腸桿菌TOP10F'基因工程菌的細胞周質空間中以可溶形式成功表達了分子量約為

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