豬α干擾素基因的克隆、表達(dá)及其抗豬瘟病毒活性的研究.pdf

1、該文進(jìn)行了豬α干擾素基因(PoIFNα)的克隆、表達(dá)及其重組蛋白抗豬瘟病毒的研究.根據(jù)DDBJ/GenBank基因庫中已登錄的豬α干擾素基因序列,設(shè)計(jì)了含SphⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn)的一對(duì)引物,采取聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)法,以豬基因組DNA為模板進(jìn)行了PoIFNα克隆.PCR產(chǎn)物經(jīng)純化回收后,插入pGEM T-Easy Vector,經(jīng)序列測定證實(shí)克隆了一新亞型豬α干擾素.隨后采用Western-Blot鑒定了表達(dá)的rPoIFNα.r

2、PoIFNα經(jīng)部分純化并充分復(fù)性后,用細(xì)胞病變抑制法測定rPoIFNα的抗濾泡性口炎病毒(VSV)活性.并進(jìn)一步在PK-15細(xì)胞上進(jìn)行抗豬瘟病毒(HCV)石門系(SM)強(qiáng)毒的試驗(yàn).結(jié)果表明,該研究克隆了一新亞型豬α干擾素的成熟肽基因序列,全長501bp,編碼166個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子組成的成熟多肽;與基因庫中的rPoIFNα比較,核苷酸同源性為97.8％,氨基酸同源性為94.6％,只有點(diǎn)置換,無插入或缺失變異.SDS-PAGE分析表

3、明,構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pQE30/PoIFNα在大腸桿菌JM109中表達(dá)的rPoIFNα占菌體蛋白總量的20~26％.Western-Blot證實(shí)表達(dá)的rPoIFNαN'端含6個(gè)組氨酸標(biāo)簽,分子量20.7KDa.rPoIFNα經(jīng)部分純化后占菌體蛋白總量的80~90％,復(fù)性后對(duì)細(xì)胞無毒性,抗病毒活性最高達(dá)1×10<'8>IU/ml.并且,在PK-15細(xì)胞上用免疫熒光反應(yīng)檢測rPoIFNα抗SM效果顯示10<'3>IU和10<'5>IU的r