豬γ-干擾素基因在畢赤酵母中的表達(dá)與活性檢測.pdf

1、豬干擾素-γ(PoIFN-γ)是由激活的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，它具有高效的抗病毒感染、抑制腫瘤細(xì)胞生長和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用，作為生物藥劑和疫苗佐劑具有廣闊的應(yīng)用前景。 為了更好地利用基因工程技術(shù)米開發(fā)重組豬干擾素吖制劑，本研究將去除信號(hào)肽的豬干擾素-γ基因置于畢赤酵母a因子分泌信號(hào)的DNA序列后，構(gòu)建成能分泌表達(dá)PoIFN-γ蛋白的重組表達(dá)載體pPIC9K-PoIFN-γ，然后將其導(dǎo)入高效表達(dá)系統(tǒng)一畢赤酵母中。

2、培養(yǎng)畢赤酵母，表達(dá)PoIFN-γ蛋白，測定其效價(jià)，為PoIFN-γ進(jìn)一步的研究與開發(fā)打下基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下： 1、用Oligo．exe(3.3)軟件設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以攜帶豬IFN-γ全基因的重組質(zhì)粒PMD-18T-PoIFN-γ為模板，通過PCR方法，擴(kuò)增出長約441bp左右的特異性條帶，膠回收該片段，用EcoRI和NotI分別雙酶切克隆質(zhì)粒PoIFN-γ成熟蛋白基因片段和pPIC9K質(zhì)粒，回收并用連接試劑盒酶連接目的片段

3、，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，質(zhì)粒抽提、酶切及PCR鑒定。結(jié)果表明，表達(dá)載體pPIC9K-PoIFN-γ得以成功構(gòu)建，DNA測序結(jié)果表明，PoIFN-γ成熟蛋白基因表達(dá)片段定向插入到表達(dá)載體啟動(dòng)子下并形成正確的開放閱讀框(ORF)。 2、用sal I酶切pPIC9K-PoIFN-γ重組質(zhì)粒，采用原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化畢赤酵母，通過MD平板和G418抗性篩選，得到重組轉(zhuǎn)化子53個(gè)。用特異性引物，在提取質(zhì)粒之后，對(duì)轉(zhuǎn)化菌株進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果顯示擴(kuò)增出了