漆酶基因在畢赤酵母中高效表達(dá).pdf

1、根據(jù)真菌漆酶銅結(jié)合區(qū)保守的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增Trametessp.420基因組，結(jié)合長(zhǎng)距離反向PCR(LD-IPCR)，成功獲得新型漆酶同工酶基因lacE?？寺〉玫降膌acE序列長(zhǎng)2717bp，包括完整的結(jié)構(gòu)基因(2130bp)、5'-和3'-非編碼區(qū)。根據(jù)已得到的Trametessp.AH28-2lacB和Trametessp.420lacA、lacB、lacC、lacD、lacE6條漆酶基因的DNA序列，設(shè)計(jì)特異引物，以逆

2、轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板擴(kuò)增得到相應(yīng)基因的cDNA序列。序列分析結(jié)果表明，這些cDNA序列長(zhǎng)度在1560～1578bp之間，與其它不同來(lái)源的真菌漆酶cDNA具有較高的一致性(＞50％)。基于cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列中均含有保守的10個(gè)His殘基和1個(gè)Cys殘基，且酶分子中含有多個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)。 將Trametessp.AH28-2lacB、Trametessp.420lacC克隆到表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K上，以α-因子前導(dǎo)序列為分泌信

3、號(hào)，在畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)。經(jīng)MD板和BMM板(含有底物ABTS)篩選得到分泌漆酶的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子在BMM液體培養(yǎng)基(含有0.3mmol/LCuSO4和0.8％丙氨酸(m/v))中20℃搖瓶培養(yǎng)。lacB的轉(zhuǎn)化子GSb1在第13天酶活達(dá)到3.2×104U/L，lacC的轉(zhuǎn)化子GSc1發(fā)酵9天的酶活為1.62×104U/L。 GSb1分泌的重組漆酶B(rLacB)對(duì)底物ABTS的

4、Km為667μmol/L，為天然漆酶B(nLacB)的4倍(177μmol/L)。以ABTS為底物，rLacB的最適溫度為45℃，低于nLacB的最適溫度(55℃)。nLacB在pH5.4時(shí)最為穩(wěn)定，而rLacB的最適穩(wěn)定pH向堿性方向發(fā)生了漂移(pH7.4)。相對(duì)nLacB，rLacB具有更寬的pH穩(wěn)定性范圍(pH3.0-9.0)。 以純化的rLacB、nLacB和GSc1分泌的重組漆酶C(rLacC)粗發(fā)酵液對(duì)終濃度50mg