豇豆胰蛋白酶抑制劑基因在畢赤酵母中的高效表達及其蛋白純化.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、本研究從原核表達載體pGEX4T-CpTI上亞克隆得到豇豆胰蛋白酶抑制劑(CpTI)基因，通過SnaBI和NotⅠ雙酶切作用，將CpTI基因按照載體閱讀框轉譯方向插入到表達質(zhì)粒PpIC9K的多克隆位點中，構建重組表達質(zhì)粒PpIC9K/CpTI。利用電轉化方法將重組質(zhì)粒轉化到表型為His-的宿主菌KM71，利用MD培養(yǎng)基篩選到500多個轉化子，再經(jīng)G418抗性的二次篩選，獲得5株含高拷貝cPTI基因的重組畢赤酵母轉化子。經(jīng)過對五株高拷貝重

2、組畢赤酵母轉化子的發(fā)酵表達，成功獲得一株高效分泌表達的重組菌株，并在發(fā)酵上清中可直接檢測到CpTI，其大小為15kD，比理論值多5kD，但是和豇豆中提取的CpTI蛋白大小一致，推測是由于兩種不同來源的蛋白有相似的糖基化修飾造成的。 對表達條件進行優(yōu)化，得到重組畢赤酵母表達CpTI的最佳發(fā)酵條件為：以BMMY和BMGY為發(fā)酵培養(yǎng)基、裝液量10％、28℃、225rpm，培養(yǎng)基起始pH值為6，甲醇濃度2％，誘導5天。該條件下發(fā)酵所得的

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