在畢赤酵母中高效表達(dá)重組蛋白酶K.pdf

1、絲氨酸蛋白酶是一類以重要的蛋白水解酶，它是以絲氨酸為活性中心的，在生物有機體中起著十分重要的生理作用，它們通過激活或者抑制蛋白酶原而起到調(diào)節(jié)因子作用。本文研究的蛋白酶K屬絲氨酸蛋白酶類，它是林伯氏白色念球菌（Tritirachium album Limber）產(chǎn)生的一類主要蛋白酶。因能合成該種蛋白酶的微生物能在以角蛋白（Kerantin）為唯一碳氮源的環(huán)境中生長，故將其稱作蛋白酶K。蛋白酶 K具有極高的酶活性和廣泛的底物特異性，能優(yōu)先分

2、解與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端鄰接的酯鍵和肽鍵，常被用于降解蛋白生產(chǎn)短肽。它具有絲氨酸蛋白酶類所具有的典型催化三聯(lián)體Asp39-His69-Ser224特征并且活性中心周圍有兩個Ca2+結(jié)合位點以增加其穩(wěn)定性，使其在更廣泛的條件下保持較高的酶活力。蛋白酶K能將蛋白失活或降解，利用其這個特性，在核酸純化、絲綢、醫(yī)藥、食品和釀造等領(lǐng)域蛋白酶 K都有著重要的應(yīng)用。因此，研究和探索蛋白酶 K的性質(zhì)，功能以及應(yīng)用，對其發(fā)展現(xiàn)狀進(jìn)

3、行展望是進(jìn)一步開發(fā)利用這種高效酶的前提。本文主要對蛋白酶K進(jìn)行優(yōu)化重組，重點對重組蛋白酶K的培養(yǎng)條件優(yōu)化，其酶學(xué)性質(zhì)的研究。
　　本研究對原始蛋白酶K基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，然后進(jìn)行全基因合成。將合成的蛋白酶K基因連接到載體pPIC9K上，組成pPIC9K-proteinase k重組質(zhì)粒，然后將線性化的pPIC9K-proteinase k重組質(zhì)粒導(dǎo)入GS115感受態(tài)細(xì)胞中，篩選出帶多拷貝目的基因的菌株，作為實驗菌株，稱為GS11-

4、pPIC9K-proteinase k。研究了溫度、起始PH、誘導(dǎo)時間和誘導(dǎo)時機四個方面對重組蛋白酶K菌株生長和蛋白表達(dá)的影響，得到重組蛋白酶K的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：重組蛋白酶K經(jīng)過BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)到OD600到達(dá)2.0的時候?qū)⑵潆x心，菌體沉淀重懸于BMMY培養(yǎng)基中培養(yǎng)72，隔24h添加0.5％(v/v)甲醇。對重組蛋白酶K進(jìn)行了鎳柱分離純化，最后的純化產(chǎn)品生物活性為12.94 U/mg，純度為93.3%,總回收率為45.4%,蛋白酶k