有機(jī)磷降解酶OPHC2在畢赤酵母中高效表達(dá)及酶活性功能與結(jié)構(gòu)關(guān)系的研究.pdf

1、常用于化學(xué)殺蟲(chóng)劑的有機(jī)磷化合物，它可以破壞乙酰膽堿酯酶的活性，導(dǎo)致乙酰膽堿的堆積，從而引發(fā)一系列神經(jīng)中毒癥狀，甚至死亡。同時(shí)，有機(jī)磷農(nóng)藥的廣泛應(yīng)用造成的環(huán)境污染也是不容忽視的。有機(jī)磷降解酶是一類(lèi)可以破壞有機(jī)磷分子的磷酯鍵，最終使有機(jī)磷化合物毒性消失的酶。因此，一方面為了實(shí)現(xiàn)有機(jī)磷降解酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，本研究嘗試在畢赤酵母中高效表達(dá)具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)和優(yōu)良酶學(xué)性質(zhì)的有機(jī)磷降解酶OPHC2。另一方面，為了了解有機(jī)磷降解酶的催化機(jī)制，對(duì)有機(jī)

2、磷降解酶活性功能與蛋白結(jié)構(gòu)的關(guān)系進(jìn)行了研究。 本研究將來(lái)源于Pseudomonaspseudoalcaligenes的有機(jī)磷降解酶基因ophc2連入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9，轉(zhuǎn)化GS115，通過(guò)篩選共得到了93株具有有機(jī)磷降解酶活性的酵母菌株，其中表達(dá)量最高的4株重組子為8＃，45＃，50＃，89＃。將這些表達(dá)量高的重組子進(jìn)行3L和3噸發(fā)酵罐的發(fā)酵研究，甲醇誘導(dǎo)120h后，表達(dá)量分別達(dá)到5.5g/L和10g/L，有機(jī)磷降解酶活

3、性分別達(dá)到10.1U/mL和20U/mL，這是目前發(fā)表的有機(jī)磷降解酶的最高表達(dá)量。重組有機(jī)磷降解酶OPHC2被分泌到培養(yǎng)液中，占總蛋白的90％以上，采用一步分子篩純化就可以得到純的重組酶。重組酶最適反應(yīng)溫度為65℃，最適反應(yīng)pH為9，具有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，尤其是熱穩(wěn)定很好，75℃下保溫30min，相對(duì)酶活性仍有66.8％。畢赤酵母中表達(dá)的重組有機(jī)磷降解酶OPHC2具有高表達(dá)量、高活性、易純化、良好的熱穩(wěn)定性等特點(diǎn)，為商業(yè)化生產(chǎn)

4、奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 采用易錯(cuò)PCR建立了OPHC2的隨機(jī)突變體庫(kù)，篩選104個(gè)重組子，得到突變酶e-10，酶的活性完全喪失，經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)它的T138變?yōu)锳。序列比對(duì)和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果表明OPHC2活性中心附近有四段保守區(qū)，該氨基酸位于第二段保守區(qū)內(nèi)，因此進(jìn)一步對(duì)該點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。分別選擇將蘇氨酸突變?yōu)榕c它最相似的絲氨酸、酸性氨基酸谷氨酸和苯環(huán)上帶有羥基的酪氨酸，結(jié)果T138S突變酶保持了與原酶一樣的活性，T138Y和T138E突變酶酶

5、活性下降極大。同時(shí)，熒光定量PCR和光譜分析結(jié)果表明這個(gè)位點(diǎn)的突變不影響基因的表達(dá)和酶蛋白的結(jié)構(gòu)，綜合以上結(jié)果推測(cè)這個(gè)氨基酸是維持OPHC2催化活性的關(guān)鍵氨基酸殘基。 此外，根據(jù)預(yù)測(cè)的四段保守區(qū)及相似酶MPH的晶體結(jié)構(gòu)研究結(jié)果，選取位于保守區(qū)段的H139、H141、H226、T227，用重疊PCR的方法得到突變體H139A、H141L、H226A、T227L、T227S，發(fā)現(xiàn)H139A、H141L、H226A、T227L，酶活性

6、完全喪失，T227S酶活性無(wú)改變； 同時(shí)，熒光定量PCR和光譜分析來(lái)研究結(jié)果表明，這些氨基酸的突變沒(méi)有影響基因的表達(dá)，也沒(méi)有使酶的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化； 綜合這些結(jié)果推測(cè)這四個(gè)氨基酸都是維持OPHC2催化活性的關(guān)鍵氨基酸殘基。 本研究對(duì)底物結(jié)合口袋處的F111、M188、F265進(jìn)行了突變研究，用重疊PCR的方法得到突變體F111A、M188A和F265A。突變酶比活性分別下降到了原酶的29.9％、7.4％、和24.4％

7、。同時(shí)，對(duì)M188定點(diǎn)飽和突變，篩選獲得M188F突變酶，該突變酶對(duì)甲基對(duì)硫磷的Kcat/Km值提高了2.48倍，說(shuō)明此處的突變?cè)黾恿说孜锱c酶蛋白的親和力。熒光定量PCR和光譜分析結(jié)果表明這些點(diǎn)的突變沒(méi)有影響基因的表達(dá)，并且他們對(duì)酶的結(jié)構(gòu)整體影響不大，僅產(chǎn)生了一些微調(diào)； 綜合這些研究結(jié)果，以及與已報(bào)道類(lèi)似酶相比較，認(rèn)為這三個(gè)氨基酸是酶與底物結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸。 研究表明OPHC2中存在一個(gè)二硫鍵，分別突變C110和C146