有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的篩選及其降解酶特性.pdf

1、1、有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌的分離、鑒定 從福建三明農(nóng)藥廠附近的土壤分離、篩選獲得一株能夠高效降解甲基1605、辛硫磷、三唑磷等有機(jī)磷農(nóng)藥的菌株JS018，該菌在LB平板培養(yǎng)基上形成的菌落為粉紅色，圓形，有光澤；經(jīng)電鏡觀察，為小球狀菌，直徑0.5μm～0.75μm；革蘭氏染色為陰性；能夠在30℃～38℃溫度范圍內(nèi)和pH7.0～9.0范圍內(nèi)很好的生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)溫度為32℃，最適pH7.5～8.0；在含有6％NaCl以上的培養(yǎng)基中，不能生長(zhǎng)

2、?？股孛舾行詫?shí)驗(yàn)表明：JS018菌對(duì)安比西林、青霉素、林肯霉素有抗性；對(duì)卡那霉素、四環(huán)素、慶大霉素等敏感。碳源發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明：該菌株能發(fā)酵葡萄糖，發(fā)酵海藻糖、松三糖、乙醇；不能發(fā)酵阿拉伯糖、蔗糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖、麥芽糖、乳糖等；不能利用棕檬酸鹽，不能液化明膠，不產(chǎn)生硫化氫，能還原硝酸鹽，不產(chǎn)生吲哚，接觸酶陽(yáng)性，脲酶陽(yáng)性。根據(jù)其形態(tài)特征，生理生化特性、16SrDNA序列分析，初步鑒定JS18為Roseomonas(玟瑰單胞菌屬

3、)，Roseomonas共有6個(gè)基因型種，其中的三個(gè)已正式命名，另外三個(gè)還沒有正式命名。從16SrDNA序列同源性分析，JS018與Roseomonasgenomospecies4同源性最高，而從其它生理生化特征分析，尤其是對(duì)七葉苷水解、甘露糖氧化、葡萄糖發(fā)酵等方面與Roseomonas屬的6個(gè)基因型種都有差別，JS018菌很可能是一種新種，國(guó)內(nèi)還沒有關(guān)于Roseomonas屬的任何菌株的報(bào)道，且國(guó)內(nèi)外尚未報(bào)道過(guò)該屬內(nèi)有降解農(nóng)藥的菌株。

4、 2、JS018菌對(duì)農(nóng)藥的降解性能及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化 JS018對(duì)甲基1605、辛硫磷、三唑磷、敵敵畏等有機(jī)磷農(nóng)藥的降解率很高，在LB培養(yǎng)基中發(fā)酵36小時(shí)，降解率分別為96％、99％、98.9％、69.0％；對(duì)喹硫磷、馬拉辛硫磷的降解率較高，分別為49.3％、49.4％；而對(duì)毒死婢幾乎不降解，對(duì)溴氰菊酯和甲氰菊酯的降解率也非常低，幾乎也不降解。 JS018產(chǎn)酶的最適培養(yǎng)基配方為：0.07％KH2PO4，0.03％K

5、,HPO4，0.02％MgSO4，0.1％葡萄糖，0.1％酵母粉，最適溫度為37℃，pH7.0。 3、JS018菌有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的純化及同源性分析 JS018菌有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶經(jīng)硫酸銨分級(jí)沉淀，SephadexG-100凝膠過(guò)濾，過(guò)濾的酶液經(jīng)電泳分析還有四種組份，進(jìn)一步經(jīng)DEAE-52柱層析，獲得的酶液經(jīng)SDS-PAGE電泳為一條蛋白帶，測(cè)得該酶的分子量約為37KDa，同時(shí)表明純化后的蛋白組分已達(dá)到電泳純。對(duì)純化后的甲

6、基1605降解酶進(jìn)行了N末端序列測(cè)定：GAPFQNDVPPACYRFR。同源性分析表明，JS018菌的甲基1605降解酶與已報(bào)道的有機(jī)磷農(nóng)藥降解菌AAK44461和NP-334647的降解酶同源性僅為29％，可能為一種新的降解酶。 4、JS018菌有機(jī)磷農(nóng)藥降解酶的特性研究及動(dòng)力學(xué)分析酶特性 研究表明：酶作用的最適溫度約為35℃，在15℃～35℃酶較穩(wěn)定；最適pH約在8.5，在pH5.5～9.0之間較穩(wěn)定；低濃度的甲醇可

7、以提高甲基1605降解酶的活性。 EDTA濃度小于1mmol.L-1時(shí)，對(duì)酶活性沒有影響或影響很小，當(dāng)EDTA濃度天于1mmol.L-1時(shí)，會(huì)抑制酶活性，抑制作用隨著濃度的增加而加強(qiáng)，當(dāng)EDTA濃度達(dá)到25mmol.L-1時(shí)，幾乎完全抑制酶的活性。1mmol.L-1Tween-20和Tween-80會(huì)抑制酶活性，抑制率分別為21.6％和16.1％。1mmol.L-1濃度的Fe2+和Ca2+有促進(jìn)酶活作用，分別提高酶活28％和14