嘔吐毒素降解菌的篩選鑒定、降解酶的純化及其特性研究.pdf

1、嘔吐毒素又稱脫氧腐鐮刀菌烯醇毒素(DON)，是一種B型單端孢霉烯族毒素，主要是由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于大自然中，容易污染谷物和飼料，給全球造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。人和動物攝入一定量被DON污染的谷物會對人類和動物健康造成嚴(yán)重的威脅，因此DON的防治研究迫在眉睫。
　　目前關(guān)于DON的脫毒方法主要有物理法、化學(xué)法和生物降解法。

2、其中由于DON的結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，物理方法的脫毒效果并不理想，化學(xué)處理法雖然能達(dá)到較好的脫毒效果，但會引入其他有害物質(zhì)并造成谷物營養(yǎng)損失，而生物降解法是通過篩選自然界中的微生物在溫和條件下降解真菌毒素，將DON轉(zhuǎn)化為無毒或低毒物質(zhì)，且不會造成營養(yǎng)丟失。因此生物降解法被認(rèn)為是去除真菌毒素的最佳方法。
　　本論文采用生物法降解DON，利用苯基環(huán)氧乙烷為唯一碳源從土壤樣品中篩選出一株能夠生物降解DON的菌株，研究其降解機(jī)理，對其發(fā)酵生產(chǎn)的D

3、ON降解酶進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，比較降解酶和菌株對DON的降解效果，并對其降解產(chǎn)物進(jìn)行分析研究。主要工作內(nèi)容歸結(jié)如下:
　　用苯基環(huán)氧乙烷作為唯一碳源，從土壤中分離到一株可以生物轉(zhuǎn)化DON的菌株As-W6，其發(fā)酵液可以降解DON，說明該該菌株分泌的一種胞外酶可以生物轉(zhuǎn)化DON。對菌株As-W6進(jìn)行形態(tài)觀察、顯微鏡鏡檢、掃描電鏡和分子生物學(xué)鑒定，菌株As-W6生長初期菌絲為白色絨毛，后變?yōu)辄S綠色，菌絲發(fā)達(dá)且有隔膜，分生孢子串生

4、、呈球形或橢球形，頂囊呈放射狀。提取菌株As-W6的DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增、送樣測序后，得到目的基因長度為531 bp，通過與Genbank數(shù)據(jù)庫(NCBI)進(jìn)行Blast序列對比，菌株As-W6與多種米曲霉同源性均達(dá)到99％。因此可確定菌株As-W6是一株米曲霉。
　　米曲霉As-W6發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸銨分級沉淀、透析、DEAE-52纖維素離子交換層析和Sephadex G-75葡聚糖凝膠過濾層析純化后得到電泳純的蛋白酶，純化倍數(shù)為

5、86.7倍，回收率為23.2％，經(jīng)過LC-MS/MS的鑒定，該酶為一種脂肪酶蛋白(ID:DQ489719)，分子量為40810.3 Da，等電點(diǎn)為5.80，包含383個氨基酸。酶學(xué)性質(zhì)研究結(jié)果表明，該脂肪酶最適反應(yīng)溫度和最適pH分別為40℃和7，在40℃以下和pH6～8之間有較好的穩(wěn)定性;Ca2+、Mg2+和Acetone能夠明顯促進(jìn)提高脂肪酶的活性，而Cu2+、Fe2+、Mn2+和SDS對其有顯著抑制作用;當(dāng)大豆油作為底物時該脂肪酶的