T-2毒素降解菌的篩選、降解酶的提取及其降解效果的研究.pdf

1、T-2毒素是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的單端孢霉烯族化合物中毒性較強的一種毒素，在自然界中存在廣泛，多存在于農(nóng)田間種植作物及貯藏的谷物糧食中，由于人和動物食用染毒的糧食作物后會導(dǎo)致各種疾病，使生物生命體健康受到威脅，因而對T-2毒素的降解作用得研究迫在眉睫。T-2毒素的毒性極強且性質(zhì)穩(wěn)定，不易因外界環(huán)境而被破壞，其結(jié)構(gòu)中的環(huán)氧環(huán)、羥基、乙酰氧基等為其毒性官能團，人畜過量食用后會對自身健康造成潛在的致癌威脅。基于上述原因，本文采用生物降解法篩選出一

2、株可以降解T-2毒素的菌株，并對其進行顯微鏡形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定，從該菌株發(fā)酵提取物中分離出降解酶并對其部分性質(zhì)進行研究，同時探討了該降解酶對T-2毒素的降解效果及其代謝產(chǎn)物。闡明了該降解酶的降解機理。主要研究結(jié)果如下：
　　(1)以苯基環(huán)氧乙烷為底物從合肥郊區(qū)玉米地和小麥地的土壤中分離篩選出一株可以生物降解T-2毒素的菌株，研究發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵液可以降解T-2毒素，因而說明該菌株產(chǎn)生的一種胞外酶可以降解T-2毒素。
　

3、　(2)對篩選出的菌株進行形態(tài)觀察、顯微鏡鏡檢、掃描電鏡和分子生物學(xué)鑒定初步推測該菌株是曲霉屬，經(jīng)PCR擴增、送樣測序后，得到目的基因長度為621 bp，將該菌株的DNA與Genbank數(shù)據(jù)庫(NCBI)進行Blast序列對比，發(fā)現(xiàn)該菌株與多種黑曲霉的同源性均達到99％，因此該菌株是一株黑曲霉。
　　(3)采用了聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳(SDS-PAGE)測定降解酶的分子量，電泳結(jié)果顯示目標蛋白位于49～85kDa之間，其分子量為

4、50kDa左右。通過研究該降解酶的性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，該降解酶的最適反應(yīng)溫度是40℃，最適pH為和8.5，Ca2+、Mg2+和Fe2+能夠進一步激活酶的活性，Zn2+、 Cu2+、Mn2+則表現(xiàn)出較強的酶活抑制作用。甲醇、乙醇、EDTA可以進一步激活酶的活性而丙酮和SDS則抑制酶的活性，對酶活性影響最大的有機溶劑是丙酮。
　　(4) HPLC的實驗結(jié)果顯示該降解酶可以降解T-2毒素且其降解率可達到70％以上。進一步采用氣相色譜法(GC)對T

5、-2毒素的降解產(chǎn)物進行分析，色譜圖中可以觀察到通過降解酶處理過的T-2毒素顯示出多種物質(zhì)的峰，而作為對照的T-2毒素色譜圖只顯示單一的物質(zhì)峰。由此，推測T-2毒素能被降解酶降解成為其他毒性較小的物質(zhì)。
　　(5)選擇健康的小白鼠隨機分組，用正常飼料喂養(yǎng)的小鼠為空白對照組，在飼料中添加T-2毒素的小鼠作為陽性對照組，剩下的3組小白鼠在喂養(yǎng)的飼料中添加了T-2毒素和不同濃度(1％、1.5％、2％)的降解酶，喂養(yǎng)30天后，在飼料中添加T