細菌信號AHL降解菌的篩選及其降解酶的研究.pdf

1、群體感應(yīng)(quorum sensing，QS)是細菌進行細胞間交流并通過調(diào)控相關(guān)基因的表達來協(xié)調(diào)群體行為的機制。?；呓z氨酸內(nèi)酯(Acyl-homoserine lactone，AHL)作為革蘭氏陰性細菌QS系統(tǒng)的一類主要的信號分子，參與調(diào)控抗生素合成，生物膜形成及毒力因子的表達等重要生物功能。研究表明，芽胞桿菌屬(Bacillus sp．)細菌產(chǎn)生的AHL內(nèi)酯酶AiiA能降解信號分子AHL，從而干擾病原菌QS系統(tǒng)的信號傳導(dǎo)而阻斷其致病

2、機制。在其他細菌以及真核生物中也存在不同類型的AHL降解酶。這些新的AHL降解酶的發(fā)現(xiàn)，將為病原菌的生物防治提供一個有效途徑。本研究的目的是利用實驗室分離保存的豐富的微生物資源，從中篩選能高效降解AHL的菌株，并對其降解酶的特征進行初步研究。 以根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)的QS模式系統(tǒng)(1~aI/R．)為模型，用“96孔板液體檢測”和“瓊脂條檢測”法，從實驗室保存的菌株中篩選到5個能高效降解

3、AHL的菌株Bt，ZS42， ZS91，ZSlO和ZSl5：其中Bt為蘇云金芽胞桿菌(B．thuringiensis)；ZS42，ZS91為番茄內(nèi)生細菌；ZSlO和ZSl5為動物源性細菌。經(jīng)形態(tài)學(xué)和16S rDNA分析，初步鑒定ZS42和ZS91為芽胞桿菌屬細菌，ZSlO和ZSl5為蒼白桿菌屬(()chrobactrum sp．)細菌。進一步實驗分析顯示，各菌株的AHL降解活性均為胞內(nèi)的酶活性。對各菌株的抗病活性進行分析j發(fā)現(xiàn)ZS42對

4、軟腐病菌歐文氏菌(帥inia carotovora．pv．cavotovora)SCGl的致病性有較強的抑制作用，Bt，ZS91能在一定程度上抑制軟腐病菌害，而ZSlO和ZSl5未表現(xiàn)出明顯的抗病活性。 為了進一步研究降解酶的特征，根據(jù)已報道的AHL內(nèi)酯酶基因aiiA兩端序列設(shè)計引物，從Bt，ZS42，ZS91基因組DNA中分別克隆了aiiA基因。序列分析表明，所擴增的3個基因片段大小均為753bp，和GenBank中已知的AH

5、L內(nèi)酯酶基因aiiA同源性達98﹪以上。推導(dǎo)得到的氨基酸序列中，均存在GloB保守結(jié)構(gòu)域，與已知AiiA一致。將aiiA基因插入到表達載體pET-17b，構(gòu)建融合表達載體pET-aiiA，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中表達。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，SDS-PAGE檢測顯示AiiA在大腸桿菌BL21(DE3)得到高效表達，大小約為29KD，與理論值相符。活性檢測顯示，表達重組蛋白AiiA的大腸桿菌有較強的AHL降解活性。 目前僅有一