α-淀粉酶基因的體外誘變及在畢赤酵母中表達(dá).pdf

1、本研究采用5-溴脫氧尿苷三磷酸(5-BrdUTP)摻入法，即在PCR反應(yīng)體系中加入一定比例的5-溴脫氧尿苷三磷酸(5-BrdUTP)部分取代脫氧胸苷三磷酸(dTTP)，對(duì)野油菜黃單胞菌α-淀粉酶基因(pHN8004)進(jìn)行體外誘變。結(jié)果表明：5-BrdUTP濃度越高，誘變?cè)綇?qiáng)；濃度越低，誘變?cè)饺?。?dāng)5-BrdUTP濃度為dTTP的0.1％時(shí)，有利于篩選到高酶活的α-淀粉酶突變基因，過(guò)高的比例則產(chǎn)生過(guò)多的失活基因，比例太小又不足以形成一定的

2、突變體庫(kù)。用LBSP鑒別培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，經(jīng)過(guò)3輪誘變和篩選，獲得一編碼α-淀粉酶且酶活力提高10倍的基因，將其克隆到pBluescriptKS(+)載體中，重組質(zhì)粒命名為pHNh301。序列分析發(fā)現(xiàn)pHNh301有三個(gè)位點(diǎn)發(fā)生堿基突變，其中一個(gè)位于-35區(qū)，是A→G的轉(zhuǎn)換。另外兩個(gè)位于編碼區(qū)，是G→A和C→T的轉(zhuǎn)換，這兩個(gè)堿基的突變?cè)斐蓛蓚€(gè)氨基酸的改變，第一個(gè)是S263N(Ser→Asn)，在緊靠保守區(qū)3區(qū)下游。第二個(gè)是R380C(Ar

3、g→Cys)，在保守區(qū)4區(qū)下游。 將重組質(zhì)粒pHNh301的α-淀粉酶基因克隆到畢赤酵母表達(dá)載體pHBM905A中，重組載體命名為pHBM905AM，將其用SalI酶切線(xiàn)性化后轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115且實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)。對(duì)重組酵母進(jìn)行誘導(dǎo)，在培養(yǎng)溫度28℃、甲醇流加量為1.0％(v/v)的情況下，第7d其分泌表達(dá)的α-淀粉酶的酶活最高，最高值為1081.30u.mL-1。該酶的最適反應(yīng)pH值和最適溫度與出發(fā)菌株相同，分別為pH5.9