嗜熱古菌高溫酸性α-淀粉酶基因BD5088的體外誘變及其突變體在大腸桿菌中的表達和酶學性質(zhì)研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、2002年，Richardson等人從一類嗜熱球菌屬(Thermococcus sp.)的古細菌中克隆并重組得到了一個α-淀粉酶基因BD5088。在熒光假單胞菌Pseudomonasfluorescens獲得表達。這個人工重組酶的最適pH為4.5，最適溫度為95℃，是一種耐熱耐酸α-淀粉酶，具有潛在的工業(yè)應用價值。
　　 BD5088基因全長1308bp，編碼的蛋白質(zhì)含436個氨基酸。該基因已由本實驗室合成，且克隆到大腸桿菌的表

2、達載體pET30a上，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET30a-BD5088。在大腸桿菌BL21(DE3)中表達，表達出的目的蛋自分子量約為48 ku，大小與理論值一致。重組α-淀粉酶BD5088具有α-淀粉酶的活性，最適反應溫度80℃，最適反應pH值為6.0，在100℃下酶活性半衰期約30min?；钚圆灰蕾囉贑a2+。
　　 本實驗首先以pET30a-BD5088為模板，設(shè)計含隨機核苷酸序列的互補引物，對α-淀粉酶基因BD5088的R32，

3、A99，N125，D126，G155，Q181，E182，A241，以及E151，A154位氨基酸進行多位點定點突變，獲得各多位點隨機突變體庫。然后將該突變體庫轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21進行表達。篩選突變體測定其α-淀粉酶活性。
　　 經(jīng)過初步篩選，選擇了8個轉(zhuǎn)化子進行DNA測序，全部發(fā)生了多位點突變。對突變子進行了α-淀粉酶活性檢測，有5個突變體的酶活高于α-淀粉酶基因BD5088。其中除了Mut5的最適溫度提高到了85℃，各突變

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