高溫α-淀粉酶耐熱嗜酸的分子改良及其高效表達的研究.pdf

1、α-淀粉酶是迄今為止應(yīng)用最為廣泛，研究較多的一種酶制劑。來源于地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因bla所表達的α-淀粉酶BLA已被商業(yè)化并得到廣泛應(yīng)用。但在實際應(yīng)用過程中，BLA還具有一定的缺陷性，比如:（1）BLA的溫度穩(wěn)定性對某些生產(chǎn)工藝還是不能滿足；（2）BLA的最適反應(yīng)pH為6.0，在低pH中的反應(yīng)效率低；（3）其表達量還有進一步提升的空間。因此開發(fā)穩(wěn)定性更加優(yōu)良表達量更高的α-淀粉酶是一項有意義的研究。
　　本研究正是針對BLA

2、的這些問題開展了相關(guān)研究工作。（1）通過對BLA的二級結(jié)構(gòu)及蛋白序列進行分析，發(fā)現(xiàn)在其四個α-螺旋中有一般不出現(xiàn)在α-螺旋中的甘氨酸，分別是G81、G216、G268、G364，我們利用定點突變技術(shù)將α-螺旋中的甘氨酸突變成丙氨酸構(gòu)建了四個突變體分別為G81A、G216A、G268A和G364A。對突變體及野生型BLA的熱穩(wěn)定性進行分析表明：突變體G81A、G216A和G268A的Tm值分別比野生型BLA提升了1.2 oC，2.4 oC

3、和2.2 oC。其中突變體G216A在70 oC保溫5 min后，突變體的酶活為未保溫時酶活的37％，而野生型保溫后的殘余酶活為17%。（2）通過使用兩個結(jié)構(gòu)相似，最適pH幾乎一致的淀粉酶BLA和BAA（來源于解淀粉芽孢桿菌）與最適pH為4.5的酸性淀粉酶PFA（來源于古菌熾熱火球菌）進行蛋白序列比對，得到六個在蛋白BLA和BAA中保守，但在PFA中有差別的區(qū)段。通過定點突變構(gòu)建相應(yīng)突變體，并對突變體進行表達純化后，分析得到BLA的26

4、4位點對其酸穩(wěn)定性有一定的影響，其中該位點的突變體 Q264D和 Q264S酸穩(wěn)定性相對于野生型 BLA有較大提升，尤其是Q264S，在pH4.5的條件下處理20 min時野生型只有60%的殘余酶活，Q264S和Q264D分別有100%和80%的殘余酶活。在此條件下處理60min時Q264S仍然能有50%的殘余酶活，野生型殘余酶活僅有25%。（3）利用隨機突變的方法對高溫α-淀粉酶基因bla進行隨機突變，并對突變體進行篩選，我們分別得到

5、了位于淀粉酶結(jié)構(gòu)域A上的正突變體A390I和位于結(jié)構(gòu)域C上的負突變體D401V，其中A390I使BLA在大腸桿菌中的可溶性表達量提高2.0倍，而負突變體D401V使BLA在大腸桿菌中的可溶性表達降低了160倍。我們通過生物信息學(xué)對BLA的結(jié)構(gòu)進行分析得到A390和D401位點可能影響著結(jié)構(gòu)域A和C之間的相互作用，我們通過后續(xù)分析和實驗驗證這種相互作用極大可能影響著蛋白質(zhì)BLA在大腸桿菌中的可溶性表達。
　　綜上所述，本研究主要是以