耐高溫α-淀粉酶定點突變及在枯草芽孢桿菌中的表達.pdf

1、淀粉酶作為目前工業(yè)上最重要的酶制劑之一，約占整個工業(yè)酶生產(chǎn)的50％。其中，耐高溫α-淀粉酶由于具備高溫條件下水解淀粉的能力，使其在食品、發(fā)酵、紡織、造紙等工業(yè)都具有極高的用途。目前，工業(yè)用的耐高溫α-淀粉酶主要為地衣芽孢桿菌α-淀粉酶(BLA)。然而，使用野生型地衣芽孢桿菌做為生產(chǎn)BLA的發(fā)酵宿主具有產(chǎn)酶量小，雜蛋白多等缺陷，因此需要開發(fā)新的工程菌來作為BLA表達宿主以滿足其大量的工業(yè)需求。另外，在某些更加極端苛刻的工業(yè)環(huán)境下，野生型B

2、LA已經(jīng)難以滿足其要求。開發(fā)耐受更高溫度，適應更低pH，且不依賴Ca2+的新型耐高溫α-淀粉酶已成為淀粉酶研究主要方向之一。
　　本研究首先通過查閱相關(guān)文獻以及專利，確定了兩個BLA氨基酸突變位點，即將野生型BLA成熟肽第190位的天冬酰胺突變?yōu)楸奖彼?，?64位的谷氨酰胺突變?yōu)榻z氨酸，從而使其具有更高熱穩(wěn)定性以及更低Ca2+依賴性。隨后將突變后的氨基酸序列針對枯草芽孢桿菌表達宿主進行了密碼子優(yōu)化，合成了突變型地衣芽孢桿菌α-淀

3、粉酶基因amyLM。在枯草芽孢桿菌168菌株中實現(xiàn)了amyLM的成功表達，90℃下測得耐高溫淀粉酶酶活為46U/ml。
　　其次，本研究為進一步提高amyLM在枯草芽孢桿菌中發(fā)酵液中的酶活進行了優(yōu)化。改用缺少8個蛋白酶的枯草芽孢桿菌WB800n工程菌作為表達宿主，并且對強啟動子P43介導amyLM的表達進行分子層面的深入研究。通過改變amyLM基因與P43啟動子SD序列之間的距離，研究了不同距離對于amyLM表達量的影響，優(yōu)化了P

4、43的使用方法。結(jié)果表明，當使用距離P43啟動子的SD序列為9bp的起始密碼子ATG作為amyLM的起始密碼子時，發(fā)酵液中BLA酶活最高，達到422U/ml，是未優(yōu)化前的9.17倍。本研究中對于P43介導amyLM的表達所進行的分子層面的優(yōu)化為后續(xù)使用P43介導其他外源蛋白的表達提供了思路。
　　最后，本研究還使用麥芽糖誘導型啟動子Pglv介導amyLM以及野生型地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因amyL在WB800n中的表達。其中，突變