TGase發(fā)酵工藝優(yōu)化及其在枯草芽孢桿菌表達(dá)研究.pdf

1、谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(transgluaminase，EC2.3.2.13，TGase)是催化蛋白質(zhì)或多肽間發(fā)生共價交聯(lián)反應(yīng)的轉(zhuǎn)移酶，可促進(jìn)蛋白質(zhì)凝膠化，在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域有廣泛應(yīng)用。微生物來源的谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶是目前研究的熱點(diǎn)，但存在活力低、穩(wěn)定性差等問題。本文以茂源鏈霉菌（Streptomyces mobaraenis）為研究對象，優(yōu)化其發(fā)酵產(chǎn)TGase工藝，研究其酶學(xué)特性;利用分子生物學(xué)技術(shù)對S.mobaraenseTGase基因

2、進(jìn)行改造，獲得高酶活性的重組枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）菌株。主要研究結(jié)果如下:
　　(1)采用單因素和正交試驗(yàn)，以TGase酶活為主要考察指標(biāo)，確定S.mobaraense產(chǎn)TGase的優(yōu)化培養(yǎng)基為(g/L):葡萄糖40，蛋白胨40，硝酸銨1，酵母膏2，MgSO42，K2HPO42。采用單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)，確定S.mobaraense產(chǎn)TGase的優(yōu)化發(fā)酵條件為:初始pH7.0，裝液量78mL，轉(zhuǎn)速150r

3、/min，溫度30℃，接種量10％(V/V)，培養(yǎng)時間96 h。
　　(2)S.mobaraense TGase發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨分級鹽析、超濾、透析冷凍干燥和凝膠層析等處理后獲得純酶。SDS-PAGE電泳顯示為一條單一明顯的條帶，其相對分子量約為37.2 kD。TGase純化倍數(shù)達(dá)5.22倍，比活力為5.73 U/mg，酶回收率為53.97％。TGase最適反應(yīng)溫度為50℃，低于40℃時酶活可保持80％以上，60℃時酶活基本喪失;T

4、Gase最適pH為7.0，在pH5.0-9.0的范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定在65％以上，其中在pH8-10堿性條件下酶活緩慢下降，在pH3.0-5.0酸性條件下快速下降。Cu2+、Zn2+、Fe2+、Fe3+、pb2+等離子對酶活有強(qiáng)烈抑制作用，而Ca2+、Mn2+、Na+等離子對酶活性影響小?？寡趸瘎┻€原型谷胱甘肽(GSH)、二硫蘇糖醇(DTT)和乙二胺四乙酸(EDTA)有助于提高TGase酶活，當(dāng)EDTA濃度為1.0mM時，相對酶活達(dá)到最大13

5、3％;當(dāng)GSH和DTT濃度為5.0 mM時，相對酶活分別為137％和128％。
　　(3)以S.mobaraense基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得TGase基因，將其與分泌型表達(dá)載體pWB980連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pWB980-sTGase轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌WB600中，實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)，經(jīng)純化和酶原激活后酶蛋白活力可達(dá)(3.33±0.21)U/mL，比活力為11.36 U/mg。利用融合PCR定點(diǎn)突變技術(shù)分別將TGase氨基酸序

6、列中第199位絲氨酸突變?yōu)楸彼?，N端前3個氨基酸DSD突變?yōu)镸，構(gòu)建兩株突變菌株B.subtilis WB600/pWB980-smtgM、B.subtilisWB600/pWB980-smtgS199A，經(jīng)表達(dá)、純化和酶原激活后其活力分別為(7.66±0.25)U/mL和(17.16±0.35)U/mL，比活力為13.38 U/mg和26.27 U/mg。所得三種重組酶蛋白（protein/smtg、protein/smtgM、pr