重組枯草芽孢桿菌生產(chǎn)核黃素發(fā)酵優(yōu)化及代謝組學(xué)研究.pdf

1、本文在重組B.subtilis RH44產(chǎn)核黃素發(fā)酵優(yōu)化的基礎(chǔ)上，基于酶活測定、代謝通量分析等方法對具有顯著影響的培養(yǎng)基成分在核黃素生產(chǎn)中的作用機理進行探討，并利用LC-MS分析手段對產(chǎn)核黃素B.subtilis RH4的代謝物組學(xué)進行研究。 首先通過一系列統(tǒng)計實驗設(shè)計方法對核黃素發(fā)酵培養(yǎng)基組成進行優(yōu)化。根據(jù)Plackett-Burman實驗確定影響核黃素生成的5個重要成分分別為葡萄糖、NaNO3、K2HPO4、ZnSO4和Mn

2、Cl2；然后，通過中心組成(CCD)設(shè)計和響應(yīng)面方法(RSM)獲得核黃素生產(chǎn)的優(yōu)化培養(yǎng)基。該優(yōu)化培養(yǎng)基在搖瓶培養(yǎng)中可獲得核黃素6.65g/L。采用RSM和神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(ANN)耦合遺傳算法(GA)兩種方法共同優(yōu)化B.subtilis RH44在5 L罐中間歇發(fā)酵核黃素的培養(yǎng)參數(shù)(pH、接種量、通氣量、攪拌速率和溫度)。ANN-GA方法可獲得核黃素最大產(chǎn)量為7.53 g/L,比RSM法高出8.6％。 對比研究了間隔補料、恒速補料和葡萄

3、糖限制補料三種間歇補料方式對B.subtilis RH44.發(fā)酵生產(chǎn)核黃素的影響。結(jié)果表明葡萄糖限制間歇補料模式(葡萄糖濃度維持在5～10 g/L)為最適合的補料方式。研究pH對B.subtilis RH44間歇補料發(fā)酵生產(chǎn)核黃素的影響表明，菌體生長的最適pH為6.8，但在pH7.2時，核黃素濃度和核黃素合成酶活性達到最大。使用pH轉(zhuǎn)換策略可明顯改善核黃素的生產(chǎn)，最大的核黃素濃度比常數(shù)pH操作的最好結(jié)果提高了13.3％。pH對副產(chǎn)物濃度

4、及相關(guān)酶比活的影響表明優(yōu)化的pH轉(zhuǎn)換策略能夠在一定程度上抑制副產(chǎn)物的形成和積累。用NH4OH代替NaOH調(diào)節(jié)pH，pH轉(zhuǎn)換策略可使核黃素濃度進一步提高，48h達到17.4 g/L。 初步探討了對B.subtilis RH44產(chǎn)核黃素具有顯著促進作用的三種培養(yǎng)基成分(NaNO3、ZnSO4和MnCl2)的作用機理。對比B.subtilis 168和B.subtilis RH44在NH4+存在時利用NO3-的情況說明B.subtil

5、is RH44已經(jīng)解除了NH4+對NO3-利用的抑制作用。進一步代謝通量分析表明，優(yōu)化氮源使發(fā)酵中后期的葡萄糖代謝流由EMP途徑向PP途徑遷移，使得更多的通量流向核黃素合成的途徑。通過酶學(xué)研究表明Mn2+激活了PP途徑的關(guān)鍵酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)的比活性，并抑制形成乙酸的相關(guān)酶磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)的比活性。根據(jù)預(yù)測的B.subtilis GTP環(huán)水解酶Ⅱ(GCHⅡ)的立體結(jié)構(gòu)，推斷Zn2+對核黃素生產(chǎn)的促進作用可能與G

6、CHⅡ有密切關(guān)系。建立產(chǎn)核黃素B.subtilis代謝網(wǎng)絡(luò)，利用代謝通量分析進一步研究Mn2+和Zn2+對核黃素生產(chǎn)過程中代謝流的影響。建立利用LC-MS分析手段進行產(chǎn)核黃素B.subtilis代謝物組學(xué)研究的方法。對不同發(fā)酵階段的胞內(nèi)代謝物負離子ESI-MS數(shù)據(jù)進行主成分分析，結(jié)果表明代謝物組學(xué)方法可以區(qū)分不同發(fā)酵階段的代謝產(chǎn)物。通過標(biāo)樣和二級質(zhì)譜對代謝物進行定性分析，可初步確定16種代謝物。根據(jù)代謝物輪廓分析分別對比研究不同發(fā)酵時間