枯草芽孢桿菌核黃素操縱子及呼吸鏈的代謝工程改造.pdf

1、本文圍繞核黃素生物合成反應(yīng)對(duì)產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌進(jìn)行了代謝工程改造,構(gòu)建了一系列產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌基因工程菌.研究了核黃素操縱子啟動(dòng)子替換及ribA基因的擴(kuò)增對(duì)產(chǎn)核黃素工程菌核黃素生物合成的影響.通過(guò)bd氧化酶缺失對(duì)枯草芽孢桿菌呼吸鏈進(jìn)行了改造.建立了枯草芽孢桿菌的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò),計(jì)算了工程菌的理論得率,并對(duì)呼吸鏈改造前后的工程菌在間歇培養(yǎng)過(guò)程中的代謝通量進(jìn)行了比較分析.最后,通過(guò)原生質(zhì)融合技術(shù)改進(jìn)了產(chǎn)核黃素基因工程菌的性能.得到的主要

2、結(jié)果如下: 利用枯草芽孢桿菌中組成型啟動(dòng)子SPO2和P43成功替換了核黃素操縱子的一級(jí)啟動(dòng)子ribP1.利用不同的整合型載體通過(guò)不同整合方式構(gòu)建了系列核黃素操縱子一級(jí)啟動(dòng)子替換的產(chǎn)核黃素基因工程菌.在構(gòu)建的所有工程菌中,以pUC18為克隆載體所構(gòu)建的含核黃素操縱子整合型載體轉(zhuǎn)化受體菌得到的工程菌B.subtilis PK具有最高的核黃素生物合成能力,與出發(fā)菌相比提高了10倍. 建立了產(chǎn)核黃素枯草芽孢桿菌生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)模型,

3、計(jì)算了工程菌B.subtilis PK的理論得率,得出該工程菌核黃素的最大合成速率為0.48mmol葡萄糖/g(CDW)/h,生物量的最大得率為0.47 g cell C/g glucose C. 研究了ribA基因的擴(kuò)增對(duì)工程菌B.subtilis RH13、B.subtilis PK和B.subtilis PK/pXJ96核黃素生物合成能力的影響.結(jié)果表明:在核黃素操縱子表達(dá)量低的工程菌中,ribA基因的表達(dá)是核黃素過(guò)量合成

4、的限制因素. 構(gòu)建了系列cyd基因缺失的產(chǎn)核黃素工程菌.對(duì)比cyd基因缺失工程菌與其受體菌發(fā)現(xiàn),cyd基因的缺失可使工程菌生長(zhǎng)速率加快,最大生物量增加,菌體維持能降低,核黃素生物合成能力增強(qiáng).通過(guò)對(duì)發(fā)酵副產(chǎn)物分析表明:cyd基因缺失工程菌中,乙酸含量明顯降低,三羥基丁酮含量明顯升高. 對(duì)工程菌B.subtilis PK/pXJ96和B.subtilis PK cyd/pXJ96通量分布的計(jì)算結(jié)果表明:cyd基因缺失可使工

5、程菌中PP途徑通量增強(qiáng),用于生物量合成的葡萄糖百分比增加,并在一定程度上削弱了溢流代謝. 基于基因組重排原理改進(jìn)了產(chǎn)核黃素工程菌的生產(chǎn)性狀,通過(guò)基因組重排得到的B.subtilis RP/pXJ96在搖瓶發(fā)酵條件下可產(chǎn)核黃素5.6g/1,比B.subtilis RH33/pMX45提高了33﹪.B.subtilis RP/pXJ96的核黃素產(chǎn)率達(dá)到0.104 g核黃素/g葡萄糖,B.subtilis PK/pXJ96相比提高了4