枯草芽孢桿菌腺苷琥珀酸合成酶的定向進(jìn)化及其代謝工程應(yīng)用.pdf

1、枯草芽孢桿菌中，purA基因編碼的腺苷琥珀酸（Adenylosuccinate，sAMP）合成酶催化IMP生成sAMP，是重要的節(jié)點(diǎn)流量控制關(guān)鍵酶。然而在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中，purA基因的失活盡管能夠提高肌苷、鳥苷以及核黃素等的產(chǎn)量，但對(duì)菌體的生長(zhǎng)都產(chǎn)生了極大影響，不僅造成后續(xù)的基因操作變得困難，同時(shí)也延長(zhǎng)了發(fā)酵周期。本研究通過(guò)前期實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和分子模擬預(yù)測(cè)結(jié)果，尋找purA基因關(guān)鍵突變點(diǎn)，構(gòu)建點(diǎn)飽和突變文庫(kù)，進(jìn)一步以突變株的生長(zhǎng)和核黃素產(chǎn)量

2、為考察指標(biāo)，篩選到sAMP合成酶的最優(yōu)滲漏突變，并研究了該滲漏突變?cè)诳莶菅挎邨U菌合成肌苷中的代謝工程應(yīng)用。
　　本研究首先構(gòu)建了木糖操縱子誘導(dǎo)的comK過(guò)表達(dá)菌SS2，作為點(diǎn)飽和突變文庫(kù)的宿主菌；隨后，構(gòu)建了含有新霉素抗性基因及purAC725T基因片段的點(diǎn)飽和突變模板質(zhì)粒pSSN-purA。進(jìn)一步利用全質(zhì)粒擴(kuò)增的方法，構(gòu)建Pro242或Thr238位點(diǎn)的點(diǎn)飽和突變文庫(kù)。根據(jù)突變株的生長(zhǎng)狀況和核黃素產(chǎn)量得到最優(yōu)突變型P242N。P

3、242N突變型菌株的生長(zhǎng)狀態(tài)與野生型幾乎一致，且其酶活較野生型降低了53.6％。說(shuō)明了P242N突變型的sAMP合成酶的酶活部分降低，能夠在保證菌體正常生長(zhǎng)的同時(shí)，提高了IMP流向GMP的通量。
　　進(jìn)一步選擇肌苷作為目的產(chǎn)物，考察P242N突變對(duì)嘌呤代謝途徑小分子代謝物產(chǎn)量的影響。首先通過(guò)敲除purR、過(guò)表達(dá)purF解調(diào)嘌呤代謝途徑；隨后，敲除肌苷分解途徑基因deoD和pupG，構(gòu)建了肌苷生產(chǎn)菌株I12；最后，向I12中引入pu