酶的定向進(jìn)化方法

1、摘要 摘要 酶的體外定向進(jìn)化是蛋白質(zhì)工程的新策略. 不需事先了解酶的空 間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制, 而是通過模擬自然進(jìn)化機(jī)制，以改進(jìn)的誘變技術(shù)結(jié)合確定進(jìn)化方向的選擇方法，在體外改造酶基因，定向選擇有價(jià)值的非 天然酶. 短期內(nèi)可以在試管中完成自然界需要幾百萬年的進(jìn)化過程，因此可能是發(fā)現(xiàn)新型酶和新的生理生化反應(yīng)的重要途徑. 關(guān)鍵詞 關(guān)鍵詞 蛋白質(zhì)工程 蛋白質(zhì)工程 模擬 模擬 定向進(jìn)化 定向進(jìn)化 --------------------------

2、-----------------------------------理論上，蛋白質(zhì)分子蘊(yùn)藏著很大的進(jìn)化潛力，很多功能有待于開發(fā)，這是酶的體外定向進(jìn)化的基本先決條件. 所謂酶的體外定向進(jìn)化 （directed evolution of enzyme in vitro）, 又稱實(shí)驗(yàn)分子進(jìn)化（experimentally molecular evolution）, 屬于蛋白質(zhì)的非合理設(shè)計(jì)（irrational design），它不需事先了解

3、酶的空間結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制〔1〕，通過人為地創(chuàng)造特殊的條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制（隨機(jī)突變、重組和自然選擇），在體外改造酶基因, 并定向選擇出所需性質(zhì)的突變酶. 酶的體外定向進(jìn)化技術(shù)極大地拓展了蛋白質(zhì)工程學(xué)的研究 研究和應(yīng)用范圍，特別是能夠解決合理設(shè)計(jì)所不能解決的問題，為酶的結(jié)構(gòu)與功能 研究 研究開辟了嶄新的途徑，并且正在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥等領(lǐng)域逐漸顯示其生命 力. --------------------------------------

4、-----------------------1 定向進(jìn)化的原理 定向進(jìn)化的原理 在待進(jìn)化酶基因的 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中, 利用 Taq DNA 多聚酶不具有 3′→5′校對功能的性質(zhì), 配合適當(dāng)條件, 以很低的比率向目的基因中隨機(jī)引入突變, 構(gòu)建突變庫, 憑借定向的選擇方法, 選出所需性質(zhì)的優(yōu)化 酶（或蛋白質(zhì)）, 從而排除其他突變體. 定向進(jìn)化的基本規(guī)則是,“獲取你所篩選的突變體”〔2〕. 簡言之, 定向進(jìn)化=隨機(jī)突變+選擇. 與

5、自然進(jìn) 化不同, 前者是人為引發(fā)的, 后者雖相當(dāng)于環(huán)境, 但只作用于突變后的分 子群, 起著選擇某一方向的進(jìn)化而排除其他方向突變的作用，整個(gè)進(jìn)化過程完全是在人為控制下進(jìn)行的. -------------------------------------------------------------2 隨機(jī)突變的策略 隨機(jī)突變的策略 2.1 2.1 易錯(cuò) 易錯(cuò) PCR PCR recombination, RPR）〔26〕以單鏈 D

6、NA 為模板, 配合一套隨機(jī)序列引物, 先產(chǎn)生大量互補(bǔ)于模板不同位點(diǎn)的短 DNA 片段, 由于堿基的錯(cuò)配和錯(cuò)誤引發(fā), 這些短 DNA 片段中也會(huì)有少量的點(diǎn)突變，在隨后的 PCR 反應(yīng)中, 它們互為引物進(jìn)行合成, 伴隨組合, 再組裝成完整的基因長度. 如果需要, 可反復(fù)進(jìn)行上述過程,直到獲得滿意的進(jìn)化酶性質(zhì)（圖 2）.該法優(yōu) 于 DNA 改組法的特點(diǎn)在于：（1） RPR 可以利用單鏈 DNA 為模板, 故可10～20 倍地降低親本 D

7、NA 量; （2） 在 DNA 改組中, 片段重新組裝前必須徹底除去 DNase Ⅰ, 故 RPR 方法更簡單; （3） 合成的隨機(jī)引物具有同 樣長度, 無順序傾向性. 在理論上，PCR 擴(kuò)增時(shí)模板上每個(gè)堿基都應(yīng)被復(fù) 制或以相似的頻率發(fā)生突變; （4） 隨機(jī)引發(fā)的 DNA 合成不受 DNA 模板長度的限制. 2.5 2.5 交錯(cuò)延伸 交錯(cuò)延伸 交錯(cuò)延伸（stagger extension process, StEP）〔

8、27〕原理的核心是, 在 PCR 反應(yīng)中把常規(guī)的退火和延伸合并為一步, 并大大縮短其反應(yīng)時(shí)間(55℃, 5 s), 從而只能合成出非常短的新生鏈, 經(jīng)變性的新生鏈再作為引物與體系內(nèi)同時(shí)存在的不同模板退火而繼續(xù)延伸. 此過程反復(fù)進(jìn)行, 直到產(chǎn)生完整的基因長度, 結(jié)果產(chǎn)生間隔的含不同模板序列的新生 DNA 分子(圖 3).StEP 法重組發(fā)生在單一試管中, 不需分離親本 DNA 和產(chǎn)生的重組DNA. 它采用的是變換模板機(jī)制, 這正是逆轉(zhuǎn)錄病

9、毒所采用的進(jìn)化過程〔28〕. 該法簡便且有效, 為酶的體外定向進(jìn)化提供了又一強(qiáng)有力的工具.2.6 2.6 酶法體外隨機(jī) 酶法體外隨機(jī)-定位誘變 定位誘變 為解決空間結(jié)構(gòu)未知酶的蛋白質(zhì)工程問題, 我們曾以類胰島素樣人參多肽基因和天冬氨酸酶基因?yàn)槟Ｐ? 探索了一種酶體外誘變的新途徑, 即酶法體外隨機(jī)-定位誘變(random-site- directed mutagenesis)〔29～32〕. 該方法的內(nèi)涵與酶的體外定向進(jìn)化類似, 對目的

10、基因既采用隨機(jī)突變增加突變位點(diǎn), 以快速產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)酶,又讓 其突變受到一定限制, 以減少篩選突變體的工作量. 實(shí)際上, 該法也是體外模擬自然進(jìn)化. 不同點(diǎn)在于，通過控制 DNA 合成的底物種類和濃度比 例實(shí)現(xiàn)堿基對的錯(cuò)配.從上述策略不難看出,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展, 可以更靈活、快 速和簡便地改造目的基因. 從功能出發(fā), 先獲得某優(yōu)化的突變體, 一方面可快速將其推向應(yīng)用, 另一方面將對蛋白質(zhì)的理論研究 研究起到更大的推動(dòng)作用