α-淀粉酶的分子定向進化及其突變體結構與功能研究.pdf

1、近年來，定向進化技術的迅猛發(fā)展，給基因工程帶來新的革命，由于其中最重要的一步必須有極大多樣性的突變體庫的建立，使核苷酸類似物這一研究工具在這一新生領域中又發(fā)揮了不可缺少的重要作用。本課題從核苷酸類似物這一獨特的視角出發(fā)，首次應用核苷酸類似物5-BrdUTP 作為PCR 體外隨機突變的誘變劑的方法，在原有的實驗基礎上，對核苷酸類似物5-BrdUTP 的突變機理進行了進一步的探討和研究。5-BrdUTP 在體外可以代替Dttp，并可低效率的

2、代替Dctp，與腺嘌呤和鳥嘌呤的錯配，造成突變。實驗結果表明，5-BrdUTP 可以產(chǎn)生12 種可能的單堿基替換突變類型中的8 種(A:T, A:G, A:C, T:C, G:A, G:C, C:A, C:T)。包括4 種轉換類型和4種顛換類型。主要突變類型為A:T→G:C (72.9％)。同時還包括堿基插入和缺失突變類型，其中還包括大片段的缺失。 本文報道的關于5-BrdUTP 致突變的新結論主要為以下幾點：(1) 以野油菜

3、黃單胞菌(Xanthomonas campestris) 野生型淀粉酶基因為模板的體外突變中存在突變熱點；(2) 突變頻率可以通過改變5-BrdUTP 加入PCR 反應體系中的濃度來控制；(3)5-BrdUTP 突變譜有一定的偏倚性，但產(chǎn)生的突變類型多樣，其中即包括轉換，也包括顛換。因此本誘變方法是一種有效的構建多樣性的突變體庫的方法。 從上述方法構建的α-淀粉酶基因突變體庫中篩選到一個截短突變體酶Xa-S2。從Xa-S2 基

4、因DNA序列推導的氨基酸序列有167 個殘基，只有野生型α-淀粉酶Xa-WT（475 個殘基）大小的35％，二級結構預測的結果顯示Xa-S2 無法折疊成完整的(β/α)8桶狀催化結構域，并且失去了野生型淀粉酶的3 個催化活性位點，但仍然具有淀粉酶的水解活性。將Xa-S2 和野生型淀粉酶基因分別構建到大腸桿菌表達載體pET30a(+)，得到重組質粒Pxas2 和Pxawt，并轉化大腸桿菌菌株BL21(DE3)，用IPTG誘導表達，得到純化

5、的Xa-S2 和Xa-WT蛋白后，對兩個酶的酶學性質進行了研究。結果表明Xa-S2 的Km值為32 mg/Ml，最適Ph為6.2，最適反應溫度為30℃。 而野生型酶Xa-WT的Km值為8 mg/Ml，最適反應Ph范圍為5.9~6.2，最適溫度范圍為45~50℃。高效液相色譜(HPLC)分析其對淀粉的最終水解產(chǎn)物類型均包含葡萄糖和麥芽糖，并以葡萄糖為主。但Xa-S2 與Xa-WT相比，在保留時間為8.0min位置多出一個產(chǎn)物峰。

6、預示著兩種酶作用于底物的方式有所不同。二級結構和三級結構預測的結果表明，野生型淀粉酶具有完整、典型的淀粉酶13 家族的(β/α)8桶狀催化結構域，3 個催化殘基和4 個典型保守區(qū)域，而Xa-S2 只包含桶狀結構的部分結構單元，即N-端的βαβαβ單元。因此，Xa-S2 為首次發(fā)現(xiàn)的只包含小于半桶狀結構的結構單元組成的有酶活性的蛋白，這對于(β/α)8桶狀結構家族的結構與進化關系的研究意義重大。 將黑曲霉(Aspergillus

7、 niger)葡萄糖淀粉酶GA-I 的SBD 結構域序列與野生型淀粉酶基因用PCR 的方法融合，得到融合酶基因XAGsbd，構建到畢赤酵母表達載體Ppic9k，得到重組質粒pPICXAGsbd，轉化畢赤酵母(Pichia pastoris) GS115 后，獲得了整合型分泌表達α-淀粉酶的重組菌株GS115(XAGsbd)，對獲得的融合蛋白進行酶學性質研究和生淀粉水解能力的研究結果表明，其最適反應條件分別為Ph5.9~6.2和45~50

8、℃，水解生淀粉的速率可以最高達到21％ (30h)。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析結果表明融合蛋白被高度糖基化。用生淀粉吸附的純化方法純化后，并用2％ β-環(huán)糊精溶液洗脫可得到純化的蛋白。 將一個編碼的淀粉酶活性提高的突變基因，克隆到由Rdna序列介導的酵母整合型表達載體Phbm368上，得到重組質粒Phbm368xa，轉化釀酒酵母Saccharomycescerevisiae INVScI后，獲得了整合型