17900.木霉內(nèi)切葡聚糖酶定向進化及高活性突變體的篩選

1、獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：時間：加／今年易月鄉(xiāng)日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解安徽農(nóng)業(yè)大學有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校

2、有權(quán)保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意安徽農(nóng)業(yè)大學可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學位論文在解密后應遵守此協(xié)議)研究生簽名：第一導師簽名：豳墊時間：洳，≯年6月7日時間：加f2年6月7日摘要lIll1IIIIIIIIIIIIIIllIY2149631纖維素是自然界中數(shù)量最大的可再生性資源，它的降解依賴于纖維素酶系，包括外切葡聚

3、糖酶(I!G)、內(nèi)切葡聚糖酶(CBH)和B葡萄糖苷酶的協(xié)同作用。內(nèi)切葡聚糖酶EGI是纖維素酶系中的主要組份，由催化結(jié)構(gòu)域、連接肽和結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，但目前報道的酶活性較低，限制了工業(yè)應用。本研究以里氏木霉(Trichodermareesei)、擬康氏木霉(Hpseudokoningii)和長枝木霉(T10ngibrachiatum)EGI基因為模板，通過DNA改組技術(shù)構(gòu)建突變體庫，并對酵母重組分泌的表達突變體篩選，主要結(jié)果如下：1分別克隆

4、了里氏木霉，擬康氏木霉和長枝木霉內(nèi)切葡聚糖酶編碼EGI的基因組DNA，其基因全長分別是1507bp，1566bp和1566bp，根據(jù)報道，它們均由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，分別編碼459，461和461個氨基酸，編碼蛋白的N端均為22aa組成的信號肽。2采用重疊PCR法獲得里氏木霉無內(nèi)含子的內(nèi)切葡聚糖酶基因egl，將去除信號肽的編碼序列插入pYEa酵母表達載體，表達的蛋白含有分泌信號肽a；以構(gòu)建含自身信號肽重組表達載體作對照。分別轉(zhuǎn)化

5、釀酒酵母，誘導后檢測到，表達含a信號肽的內(nèi)切葡聚糖酶的重組細胞有活性；而對照無明顯活性。說明a信號肽可有效地將EGI成熟肽分泌至胞外。3采用重疊PCR法分別獲得擬康氏木霉和長枝木霉內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因，構(gòu)建酵母分泌表達載體，分別轉(zhuǎn)化釀酒酵母，重組轉(zhuǎn)化子檢測到酶活。4對3種木霉成熟肽編碼序列進行DNA改組，構(gòu)建突變體庫，通過活性篩選獲得高活性突變體，命名為New8。它在誘導培養(yǎng)96h達到活性最高197U／mL，是3種木霉的野生型EGI平均

6、酶活的19倍；最適溫度為50。C，最適pH為56，與其他3種木霉相似。SDSPAGE電泳顯示New8亞基蛋白分子量比理論分子量偏大。5亞克隆New8egl，由1320bp組成，核苷酸序列分析表明與里氏木霉，擬康氏木霉和長枝木霉的相似度分別為94％，95％，96％，有114個重組位點和4個突變位點。New8EGI與3個原始EGI之間的同源性為95％，96％，97％。在4個突變位點中，V10A和F192L未引起New8EGI疏水性改變，G1

7、00S和S318G引起親水性改變。蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)：果表明，突變位點$318G在催化結(jié)構(gòu)域的活性中心附近。綜上所述，本文克隆了里氏木霉，擬康氏木霉和長枝木霉內(nèi)切葡聚糖酶基因egl；建立了木霉EGI釀酒酵母胞外分泌表達體系；并將這一體系運用于木霉egl多基因改組酵母文庫的初步構(gòu)建及篩選；獲得一內(nèi)切葡聚糖酶新基因。這一研究將為今后纖維素酶系中其它酶類(CBH、BG)的基因改造，乃至構(gòu)筑高效的纖維素降解體系奠定良好的前期基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：內(nèi)切