表皮生長因子體外定向進(jìn)化及對突變體結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、人表皮生長因子(human epidermal growth factor，hEGF)發(fā)現(xiàn)于1962年，是一種由53個(gè)氨基酸殘基組成的單體多肽。已證實(shí)hEGF是一種關(guān)鍵性的創(chuàng)傷愈合因子，通過與其受體的結(jié)合，它能對上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生很強(qiáng)的致分裂作用；能促進(jìn)皮膚、角膜、肺和氣管上皮組織等的增殖和分化；對表皮損傷和潰瘍具有良好修復(fù)功能；臨床上對腸、胃、肝等器官表面損傷的修復(fù)和再生也有顯著療效?？傊?，hEGF在醫(yī)療、美容護(hù)膚等方面有著廣泛的

2、應(yīng)用前景。
　　 但是由于其自身半衰期較短等不利因素，至今尚未得到廣泛的使用，利用分子手段將它進(jìn)行改造已成為必然。針對EGF的三維結(jié)構(gòu)已比較清楚但結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)系并不清楚而且EGF分子本身很小不利于改組的情況，本研究采用易錯(cuò)PCR和StEP聯(lián)合的方法將hEGF和pEGF(pig EGF豬表皮生長因子)的DNA進(jìn)行分子定向進(jìn)化。通過多次嘗試，探索了簡便、有效、優(yōu)化的EGF體外定向進(jìn)化的技術(shù)路線，構(gòu)建了定向進(jìn)化文庫，用SSCP初

3、步檢測文庫突變率可以達(dá)到其它大分子改組的水平。然后將突變文庫構(gòu)建成噬菌體展示文庫，通過活細(xì)胞噬菌體展示、ELISA和MTT的方法篩選到活性增強(qiáng)的突變體E40V，為EGF體外定向進(jìn)化提供可借鑒經(jīng)驗(yàn)。通過測序我們發(fā)現(xiàn)了其突變?yōu)?0Glu→Val，為了解這一突變引起的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化，對E40V和hEGF進(jìn)行了圓二色譜的檢測，并分析了這些變化對EGF活性增強(qiáng)的貢獻(xiàn)，為了解EGF結(jié)構(gòu)與功能之間聯(lián)系打開新的視角。
　　 此外，本研究構(gòu)建了pE