表皮生長(zhǎng)因子對(duì)體外長(zhǎng)期孵育保存的人胎胰島的支持作用

1、<p>　　表皮生長(zhǎng)因子對(duì)體外長(zhǎng)期孵育保存的人胎胰島的支持作用</p><p>　　【關(guān)鍵詞】 尿抑胃素 </p><p>　　【Abstract】 AIM: To investigate the effects of epidermal growth factor (EGF) on the proliferation and secretion of human embry

2、onic pancreatic islets in vitro. METHODS: Islets were isolated from pancreases of twelve human embryos and cultured in RPMI 1640 medium containing EGF (study group) or without EGF (control group). The percentage of isle

3、t beta cells was detected. The insulin content in the media, islet cells and islet beta cells insulin release were measured. RESULTS: By the end of cultu</p><p>　　【Keywords】 islets of langerhans;preservatio

4、n, biological;epidermal growth factorurogastrone </p><p>　　【摘 要】 目的： 研究表皮生長(zhǎng)因子（EGF）對(duì)促進(jìn)人胎胰島增殖與分泌功能.方法: 12個(gè)人胎胰島分別在含有EGF（實(shí)驗(yàn)組）和不含有EGF（對(duì)照組）的培養(yǎng)基中孵育，觀察胰島B細(xì)胞的分布，測(cè)定培養(yǎng)基中和細(xì)胞內(nèi)胰島素濃度和胰島素釋放量.結(jié)果: 培養(yǎng)結(jié)束后實(shí)驗(yàn)組胰島B細(xì)胞明顯高于對(duì)照組；培

5、養(yǎng)基和胰島B細(xì)胞中胰島素釋放量實(shí)驗(yàn)組高于對(duì)照組.結(jié)論: 培養(yǎng)液中加入EGF能延長(zhǎng)胰島細(xì)胞存活期、促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖和分泌功能. </p><p>　　【關(guān)鍵詞】胰島；保存，生物學(xué)；表皮生長(zhǎng)因子尿抑胃素 </p><p><b>　　0 引言 </b></p><p>　　為了有足夠數(shù)量的健康胰島供給臨床移植使用，國(guó)內(nèi)外都在積極研究長(zhǎng)期保存

6、胰島的方法［1,2］.經(jīng)典的深低溫保存方法，需要較貴重的設(shè)備，操作繁雜，復(fù)蘇后胰島的失活率＞30%；孵育保存的方法胰島難以長(zhǎng)期存活，但只能維持1 mo，最多達(dá)5 mo［3］，胰島細(xì)胞的調(diào)亡在所難免.我們研究了表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor）具有促進(jìn)人胎胰島的增殖分泌作用.通過觀察胰島細(xì)胞的形態(tài)，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)胰島素和胰島釋放量，以及胰島組織的存活期，探討更有意義的保存胰島的方法. </p><

7、;p>　　1 材料和方法 </p><p>　　1.1 材料 EGF購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)液、人血清購(gòu)自北京幫定醫(yī)藥公司.百級(jí)凈化實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，所有操作在潔凈工作臺(tái)進(jìn)行. </p><p>　　1.2 方法 </p><p>　　1.2.1 人胎胰島的獲取 平均胎齡21周的人胎胰12例.經(jīng)4℃無

8、菌Hanks液漂洗，去除胰腺包膜、血管、胰管，剪為1 mm大小的碎塊，再次漂洗后置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi). </p><p>　　1.2.2 孵育條件 RPMI1640培養(yǎng)液中加入80 mL&#12539;L-1同型人血清、丁胺卡那霉素100 u&#12539;mL-1；培養(yǎng)箱中37℃, 50 mL&#12539;L-1 CO2培養(yǎng)；隔日更換1/3培養(yǎng)液，共孵育14 d. </p

9、><p>　　1.2.3 分組 12個(gè)人胎胰島隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組.實(shí)驗(yàn)組：表皮生長(zhǎng)因子（EGF），100 ng&#12539;mL-1約1 mL加入上述孵育胰島14 d的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，共6瓶.每次更換培養(yǎng)液時(shí)均按此濃度加入EGF.對(duì)照組:未加EGF培養(yǎng)瓶做為對(duì)照組,共6瓶.更換培養(yǎng)液時(shí)也不加EGF. </p><p>　　1.2.4 觀察指標(biāo) 免疫組織

10、化學(xué)的病理學(xué)觀察：不同孵育時(shí)限分別收集胰島細(xì)胞，100 mL&#12539;L-1甲醛固定，石醋切片，HE染色及胰島素和高糖素抗體酶標(biāo)染色，觀察細(xì)胞有絲分裂相及胰島B細(xì)胞分布情況. </p><p>　　不同孵育時(shí)限時(shí)胰島功能指標(biāo)的觀察：培養(yǎng)液中胰島素分泌量；胰島素釋放試驗(yàn)（低糖和高糖加茶堿刺激）. </p><p>　　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，采用方差分析進(jìn)行

11、組間均數(shù)比較. </p><p><b>　　2 結(jié)果 </b></p><p>　　2.1 酶標(biāo)組織化學(xué)染色的組織學(xué)結(jié)果 光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)胰島的觀察均值,每個(gè)胰島中隨機(jī)計(jì)數(shù)10個(gè)胰島細(xì)胞中的組織學(xué)改變:有絲分裂細(xì)胞的比率、胰島素和胰高血糖素分泌顆粒的數(shù)目等.孵育30 d以內(nèi)，組間未觀察到明顯差異（P＞005）；3 mo時(shí)，對(duì)照組胰

12、島細(xì)胞內(nèi)已無胰島素和胰高血糖素的分泌顆粒，細(xì)胞核固縮或崩解；而ECF組的分泌顆粒至6 mo時(shí)仍不減少，9 mo時(shí)減少13.6%，細(xì)胞形態(tài)觀察無明顯變化.不同孵育時(shí)限的胰島中有絲分裂細(xì)胞情況見Tab 1. </p><p>　　表1 不同孵育時(shí)限對(duì)胰島中有絲分裂細(xì)胞比率的影響（略） </p><p>　　Tab 1 Effect of islets beta cells ra

13、te in different cultured time (略) </p><p>　　2.2 不同孵育時(shí)限的胰島功能指標(biāo)觀察結(jié)果 見Tab 2.胰島素釋放試驗(yàn)（低糖和高糖加茶堿刺激），與培養(yǎng)液中胰島素分泌量的變化同步，對(duì)照組3mo以后對(duì)釋放試驗(yàn)無反應(yīng),而ECF組反應(yīng)敏感，并保持到9 mo以后. </p><p>　　表2 不同孵育時(shí)限時(shí)培養(yǎng)液中胰島素分泌量的改

14、變（略） </p><p>　　Tab 2 Change of serection in insulin culture media in different culture time （略） </p><p><b>　　3 討論 </b></p><p>　　近年來，胰島移植的研究集中在移植部位、移植途徑、抗排異反應(yīng)、和胰島

15、的保存等方面［4,5］.胰島移植的臨床應(yīng)用中每一受體均需要足夠量的成熟健康的胰島［6-8］，而一般胰島孵育保存的最佳時(shí)期在1 mo［3］.在此期間內(nèi)，培養(yǎng)液中胰腺小塊組織的外分泌組織和結(jié)締組織細(xì)胞逐步退化減少，而胰島組織能增殖和成熟［1，9］.但孵育1 mo后胰島細(xì)胞開始凋亡，其分泌功能下降.1 mo的短時(shí)期內(nèi)常不能積攢足夠的胰島，所以心須設(shè)法延長(zhǎng)胰島的孵育保存時(shí)間. </p><p>　　表皮樣生長(zhǎng)因子（EGF

16、）的Mr為6000左右，熱穩(wěn)定，是含有5個(gè)氨基酸殘基的多肽，存在于人和動(dòng)物的尿液、乳汁和血漿中，對(duì)多種細(xì)胞是很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂因子，能促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖、成熟、并保持活力［10-12］.但尚無EGF作用于胰島保存的報(bào)道.在本實(shí)驗(yàn)中，胰島形態(tài)學(xué)檢查提示，含EGF培養(yǎng)液的孵育能刺激長(zhǎng)期保存的胰島正常分泌胰島素和胰高血糖素；胰島細(xì)胞中有絲分裂相的變化提示ECF對(duì)長(zhǎng)期保存的胰島細(xì)胞的增殖有顯著的促進(jìn)作用.培養(yǎng)液中胰島素含量檢測(cè)和胰島素釋放試驗(yàn)結(jié)果同

17、樣提示了上述結(jié)論. </p><p>　　在EGF作用下，孵育9 mo的胰島仍保持較好對(duì)高糖、茶堿刺激的敏銳反應(yīng)性.在胰島細(xì)胞培養(yǎng)液中加入,可延長(zhǎng)胰島細(xì)胞存活期至10 mo以上，并促進(jìn)細(xì)胞增殖，使胰島細(xì)胞分泌旺盛.本研究為臨床移植提供足量的健康胰島奠定可靠基礎(chǔ). </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　?。?］

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