表皮生長因子(EGF)與大腸癌關系的研究.pdf

1、目的:研究表皮生長因子(EGF)在臨床大腸癌組織中表達及意義;探討EGF基因多態(tài)性與大腸癌發(fā)病的相關性;揭示抑制EGF基因表達對大腸癌細胞的生長增殖作用及機制。
　　 方法:通過免疫組化的方法檢測分析臨床大腸癌病理標本中EGF的表達。選取50名大腸癌患者病理組織標本，結腸癌31例，直腸癌19例。高分化腺癌為12例，中分化腺癌為29例，低分化腺癌為9例。依據TNM分期分類，Ⅰ期9例，Ⅱ期16例，Ⅲ期17例，Ⅳ期8例。對照組選取標本

2、邊緣正常大腸組織。所有標本切片后采用免疫組化方法染色，細胞漿和/或細胞膜如果呈現棕黃色染色顆粒則設定細胞EGF染色陽性。每張切片均有兩位病理醫(yī)師觀察，采用雙盲法，每張切片隨機選擇10個視野用400倍顯微鏡觀察。積分分級法記錄染色結果。染色強度:染色無色0分，染色淺黃色評定為1分，染色棕黃色評定為2分，染色棕褐色評定為3分。陽性細胞數:無陽性染色細胞評定為0分，陽性染色細胞數25％評定為1分，陽性染色細胞數26-50％評定為2分，陽性染色

3、細胞數51-75％評定為3分，陽性染色細胞數＞75％評定為4分。染色積分為上述兩項之和，標本染色分級如下:（一）為陽性細胞數0分，（±）為陽性細胞數2-3分，(+)為陽性細胞數4-5分，(++)為陽性細胞數6-7分，其中染色陽性為(+)和(++)的標本。驗證其表達情況。同時，對大腸癌組織中EGF表達情況與臨床指標關系進行研究，進行統計學處理，兩組間對比應用x2檢驗，P＜0.05有統計學意義。
　　 利用聚合酶鏈反應-限制性片段長

4、度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術研究EGF基因多態(tài)性。檢驗180名大腸癌患者EGF基因型，病例組年齡區(qū)間為35-84歲，平均年齡60.8歲，其中女性患者85名，男性患者95名。對照組年齡區(qū)間為55-65歲，平均年齡61歲，其中女性患者87名，研究EGF+61GG基因型與大腸癌的關系。所有病人抽靜脈血，提取DNA經PCR擴增后，使用限制性內切酶AluI酶切，將酶切后產物進行瓊脂糖凝膠電泳，統計患者EGF+61位點基因型，研究所有大腸癌患者

5、EGF+61基因多態(tài)性分布狀況。
　　 利用RNAi技術探討EGF的缺失對大腸癌細胞生長增殖的影響。查詢EGFmRNA核苷酸序列，通過軟件設計針對EGF的siRNA，通過化學合成的方法合成三條GF-siRNA，通過Lipofectamine 2000質粒轉染到培養(yǎng)好的SW620大腸癌細胞中，利用羧基熒光素（FAM）檢測轉染效率，再通過RT-PCR研究EGF-siRNA對SW620大腸癌細胞EGF基因表達的影響，提取轉染后的大腸癌

6、細胞中RNA，通過SuperScriptⅡ反轉錄酶作用轉換成DNA，將所得的DNA進行PCR擴增并電泳，選擇沉默EGF基因效果最好的EGF-siRNA，采用MTT法研究SW620大腸癌細胞EGF基因受到干擾后，細胞生長受抑的情況，在一定數量的細胞中，產生的藍紫色針狀結晶與細胞的數量幾乎成正比。因此，MTT試驗測得的OD值與細胞數成正比?？梢酝ㄟ^吸光值來計算細胞的數量。mRNA受到抑制可導致細胞數量增長減緩。，通過吸光值可以間接計算細胞生

7、長抑制率=（1一實驗組A490nm/對照組A490nm）×100％，并根據結果繪制生長曲線。不同處理組細胞經48小時培養(yǎng)后，常規(guī)消化收集細胞，Annexin V和PI染液室溫共孵育30min，流式細胞學檢測，CellQuest軟件分析熒光強度。
　　 結果:表皮生長因子(EGF)在臨床大腸癌組織中呈高表達，并與大腸癌組織分化、分期及轉移存在關聯性。EGF在大腸癌細胞中表達主要集中于細胞的細胞漿和（或）細胞核中，EGF染色表現為黃

8、色的片狀染色區(qū)域。所檢測的50例大腸癌患者的腫瘤組織中有27例EGF染色陽性(54.00％);50例對照組癌旁粘膜中僅有5例EGF染色陽性(10.00％)。數據經統計學處理后如下:EGF在大腸癌腫瘤細胞中的表達水平明顯強于其在癌旁粘膜細胞中的表達（P＜0.05）。EGF在腫瘤組織中的表達與腫瘤的分化程度存在關聯，實驗中男患者EGF染色陽性率為57％，女患者EGF染色陽性率為53％;年齡50歲以上的（包括50歲）患者EGF染色陽性率為54

9、.84％，50歲以上的患者EGF染色陽性率為56.25％;這些分類方法中各組之間比較無統計學差異（P＞0.05）。以TNM分期分組，Ⅰ期為33.33％、Ⅱ期為43.75％、Ⅲ期為58.82％、Ⅳ期為75％，但是將Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ、Ⅳ比較有統計學差異（P＜0.05）;EGF染色陽性率與腫瘤分化有相關性，根據分化程度分類，高分化組為25％、中分化組為62.07％、低分化組為77.78％，其中EGF染色陽性率在高分化組與中分化兩組之間比較有統計學差

10、異(P＜0.05)，而在中分化組與低分化兩組之間比較無統計學差異（P＞0.05）。
　　 通過PCR-RFLP方法，發(fā)現EGF+61GG基因型與大腸癌發(fā)病存在相關性。大腸癌患者EGF+61GG基因型顯著高于對照組(OR=1.93，95％可信區(qū)間(CI)=1.07，3.50; p=0.03)，EGF+61GG基因型的中國人群患大腸癌的幾率比EGF+61AG或EGF+61AA的人群高，通過分層分析大腸癌患者腫瘤部位、大小、生長形態(tài)、

11、分化、TNM分期等大腸癌臨床指標與EGF+61無統計學相關性。
　　 選用大腸癌SW620細胞作為EGF表達強度與大腸癌細胞生長增殖相關性研究的體外細胞模型，利用EGF-siRNA干擾或下調EGF，通過MTT實驗證實，在EGF-siRNA3轉染SW620細胞后，與對照組和轉染組相比較，在轉染后48小時至96小時，觀察到EGF-siRNA3組細胞數量的明顯減少，此結果證實EGF-siRNA可以明顯抑制SW620細胞生長增殖，且EG

12、F-siRNA在轉染后48細胞開始發(fā)揮生長增殖抑制的作用并可延長至轉染后96小時。另外，在96小時的時間點上，EGF-siRNA的轉染增強SW620細胞增殖抑制。應用Annexin V與PI雙染色結果顯示:實驗組細胞和對照組/轉染組比較，Annexin V+PI-百分比明顯增高，此結果提示EGF-siRNA3誘導細胞凋亡，即下調或干擾EGF抑制SW620細胞增殖的重要機制為凋亡誘導。
　　 結論:EGF的表達與大腸癌的發(fā)生發(fā)展呈