木聚糖酶基因的體外定向進(jìn)化及其高拷貝重組酵母的構(gòu)建.pdf

1、木聚糖是谷物類飼料中一種主要的抗?fàn)I養(yǎng)因子，通常需要添加內(nèi)切木聚糖酶(EC3.2.1.8)破壞木聚糖長鏈結(jié)構(gòu)，釋放出短鏈木寡糖，在木糖苷酶(EC3.2.1.37)的協(xié)同作用下，木聚糖可最終被水解成木糖。近年來，內(nèi)切木聚糖酶已被廣泛應(yīng)用于飼料、食品和制漿造紙工業(yè)等，此外以木糖為底物生產(chǎn)燃料乙醇的研究也具有廣闊前景。然而，目前木聚糖酶仍存在酶的催化活性不高、酶學(xué)特性不能滿足工業(yè)加工或生產(chǎn)應(yīng)用的需求或酶的生產(chǎn)成本較高等不足，亟需開發(fā)兼具高活性且

2、酶學(xué)特性優(yōu)良的理想木聚糖酶基因及其高效表達(dá)宿主。本研究克隆了糖苷水解酶家族11的4種內(nèi)切木聚糖酶基因和1種木糖苷酶基因，以其中的優(yōu)良基因?yàn)榛A(chǔ)對(duì)其進(jìn)行分子改良，構(gòu)建了相應(yīng)的高拷貝重組酵母表達(dá)宿主，在搖瓶中發(fā)酵表達(dá)內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶，并對(duì)底物形態(tài)和水解特性進(jìn)行分析。主要結(jié)果如下:
　　 1內(nèi)切木聚糖酶與木糖苷酶基因的克隆及原核表達(dá)
　　 本研究克隆了家族11黑曲霉(Aspergillus niger xylanase，

3、anx)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis xylanase，bsx)、褐色高溫單孢菌（Thermomonospora fuscaxylanse，tfx）和雜合內(nèi)切木聚糖酶(hybrid xylanse，atx)基因以及枯草芽孢桿菌來源的木糖苷酶(B.subtilis xylosidase，xylo)基因，并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)。酶學(xué)特性分析發(fā)現(xiàn)，所有木聚糖酶均在酸性條件下較為穩(wěn)定。其中，ATx和Tfx兼具高酶活性和良好

4、的熱穩(wěn)定性，且Tfx具備良好的抗抑制劑特性和一個(gè)家族11木聚糖酶少有的碳水化合物結(jié)合域(carbohydrate binding module，CBM)。因此，atx和tfx可作為后續(xù)分子改良的基因材料。
　　 2 atx的分子改良及重組酵母菌的構(gòu)建
　　 基于非理性設(shè)計(jì)思路，采用定向進(jìn)化提高atx的催化活性。定向進(jìn)化策略包括易錯(cuò)PCR(error-prone PCR，EP-PCR)產(chǎn)生隨機(jī)突變，在微孔板上篩選木聚糖酶活

5、性提高的優(yōu)勢(shì)突變體。一輪EP-PCR后共篩選1530個(gè)轉(zhuǎn)化子得到一個(gè)酶活性提高的突變體基因FSI-A124。將atx和FSI-A124分別轉(zhuǎn)化畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115，在PGAp啟動(dòng)子和α交配因子信號(hào)肽的控制下分泌表達(dá)木聚糖酶，96 h發(fā)酵上清液中比活性分別為954和1556 U/mg。突變酶YFSI-A124的Km為4.25 mg/ml，較之野生酶YATx下降4.7％，催化轉(zhuǎn)化數(shù)kcat則提高44％。然而，

6、酶學(xué)特性分析顯示，YFSI-A124熱穩(wěn)定性略有下降。氨基酸比對(duì)和三維結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，L49P替換使得酶的催化區(qū)域變得柔和，突變酶與底物木聚糖的親和能力增強(qiáng)，酶的催化效率提升，另一方面氫鍵作用、相鄰氨基酸之間的范德華力和表面疏水作用減弱，導(dǎo)致酶的熱穩(wěn)定性下降。
　　 3tfx的分子改良
　　 綜合非理性設(shè)計(jì)和理性設(shè)計(jì)的優(yōu)勢(shì)，采用定向進(jìn)化和定點(diǎn)突變相結(jié)合的技術(shù)，提高tfx的催化活性和熱穩(wěn)定性。首先利用兩輪EP-PCR隨機(jī)突變

7、，經(jīng)微孔板篩選約7000個(gè)突變體，獲得6個(gè)木聚糖酶活性提高的優(yōu)勢(shì)突變體。并對(duì)其中4處可能與酶的催化活性或熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸殘基進(jìn)行序列飽和突變。將優(yōu)勢(shì)突變體用于DNA shuffling和StEP進(jìn)行優(yōu)勢(shì)重組，經(jīng)篩選3000個(gè)轉(zhuǎn)化子共獲得3個(gè)木聚糖酶活性提高的優(yōu)勢(shì)突變體。之后，將S144C點(diǎn)突變引入G3DS2，使分子內(nèi)產(chǎn)生一個(gè)新的二硫鍵，獲得兼具高活性和良好熱穩(wěn)定性的突變基因G4SM1(S62T/S144C/N198D/A217V)。

8、G4SM1的特異性比活為2036±45.8 U/mg，是野生酶Tfx的2.12倍，而Km值為1.84 mg/ml，較之野生酶顯著下降(P＜0.05)，而kcat/Km提高76％，提示酶與底物的親和能力增強(qiáng)，且酶的催化效率提高。三維結(jié)構(gòu)分析顯示，推測(cè)位于催化區(qū)的兩處氨基酸替換S62T和S144C有助于提高酶的催化活性和穩(wěn)定性。
　　 4構(gòu)建包含高拷貝G4SM1基因的重組酵母菌
　　 采用兩種不同的方法構(gòu)建包含高拷貝G4SM

9、1及其催化區(qū)G4SM1_CBM基因的重組酵母。一是采用高濃度抗生素壓力法篩選酵母轉(zhuǎn)化子，將電擊后的轉(zhuǎn)化子分別涂布于含500、1000、1500和2000μg/mlzeocin的YPD平板，在1500和2000μg/mlzeocin的平板上挑取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行拷貝數(shù)鑒定，Southern blot和qPCR分析顯示，28號(hào)菌株為包含兩拷貝G4SM1的重組酵母菌，命名為33-1。研究發(fā)現(xiàn)，Tfx中包含一段沒有催化活性的CBM2，為了減少高拷貝

10、外源基因?qū)λ拗鞯膲毫Γ瑢fx中不影響其其催化活性的CBM2截去，采用一對(duì)同尾酶BamHⅠ和BgⅡ?qū)⒈磉_(dá)盒頭尾相連，構(gòu)建一個(gè)包含四拷貝表達(dá)盒的穿梭載體pGAPZαA/G4SM1_CBM(4)，再將該載體轉(zhuǎn)化P.pastoris SMD1168獲得包含四拷貝G4SM1_CBM基因的重組酵母33-2，Southern blot和qPCR進(jìn)一步驗(yàn)證其正確性。
　　 5共表達(dá)內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶的重組酵母菌的構(gòu)建及搖瓶發(fā)酵、底物形態(tài)和

11、水解特性分析
　　 利用BamHⅠ和BglⅡ?qū)GAPZαA/G4SM1_CBM(4)與包含木糖苷酶基因的pPI CZαA/xylo相連接，獲得共表達(dá)內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶的重組載體pαAX-GAPGC(4)，轉(zhuǎn)化P.pastoris SMD1168獲得共表達(dá)宿主33-3。將菌株33-1和33-2在YPD培養(yǎng)基中分泌表達(dá)內(nèi)切木聚糖酶，培養(yǎng)120 h后發(fā)酵上清液中總蛋白含量分別為0.49 g/l和0.65 g/1。菌株33-3能在

12、YPD培養(yǎng)基中僅表達(dá)內(nèi)切木聚糖酶，同時(shí)也能在甲醇的誘導(dǎo)下共表達(dá)內(nèi)切木聚糖酶和木糖苷酶，120 h發(fā)酵上清液中總蛋白含量達(dá)1.22 g/l。底物形態(tài)和水解特性分析顯示，未處理的樺木木聚糖結(jié)構(gòu)致密、表面粗糙，多糖分子粘連程度高，經(jīng)內(nèi)切木聚糖酶水解后，長鏈結(jié)構(gòu)被破壞，分子呈現(xiàn)較小的顆粒狀態(tài)，表面形態(tài)趨于平整。水解24 h后，木二糖和木三糖的濃度分別為0.954±0.093 mg/ml和0.360±0.022 mg/ml，分別占總水解產(chǎn)物的62