β-葡聚糖酶的定向進(jìn)化及熱穩(wěn)定性研究.pdf

1、β-葡聚糖酶是重要的工業(yè)用酶，可有效消除谷物β-葡聚糖在釀造和飼料工業(yè)中產(chǎn)生的負(fù)面影響。與國(guó)外相比，我國(guó)對(duì)β-葡聚糖酶的研究起步較晚，且研制的β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性普遍較差，不能滿足現(xiàn)代啤酒糖化工藝和顆粒飼料造粒的溫度要求，因此提高β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性具有非常重要的意義。本課題以大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)克隆和重組表達(dá)了β-葡聚糖酶基因；建立了高通量篩選耐熱β-葡聚糖酶的方法；以克隆的β-葡聚糖酶基因?yàn)槠鹗疾牧?，通過(guò)設(shè)計(jì)的定向進(jìn)化策略和建立的篩

2、選手段提高野生型β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性；檢驗(yàn)所構(gòu)建的熱穩(wěn)定性重組菌株的遺傳穩(wěn)定性；對(duì)熱穩(wěn)定性突變株EGs2的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化；篩選并優(yōu)化出提高β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的復(fù)合保護(hù)劑；估算了熱穩(wěn)定性β-葡聚糖酶的儲(chǔ)藏壽命。主要研究結(jié)果如下：從BacillussubtilisZJF-1A5中克隆了大小為849bp的β-葡聚糖酶基因。通過(guò)序列比對(duì)，該基因編碼的氨基酸序列與BorrissR、Sun，J和Hidetoshi發(fā)表的β-葡聚糖酶的氨基酸序列

3、分別有1-3氨基酸的替換。β-葡聚糖酶基因經(jīng)BamHI和HindⅢ雙酶切后與用同樣限制性內(nèi)切酶切割的載體pET28a(+)進(jìn)行重組表達(dá)，得到了27KD的有活性的β-葡聚糖酶。對(duì)酶在宿主細(xì)胞中的位置進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示：β-葡聚糖酶不僅分泌至細(xì)胞外，而且也存在于細(xì)胞內(nèi)和周質(zhì)空間。發(fā)酵上清液經(jīng)硫酸氨鹽析沉淀和DEAECellulose52離子交換柱層析，純化的β-葡聚糖酶經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，純化產(chǎn)品為單一條帶，分子量約27KD。純化的

4、β-葡聚糖酶的熱學(xué)性質(zhì)研究表明：β-葡聚糖酶的Tm值為62.5℃，最適反應(yīng)溫度為55℃。 本研究將定位膜轉(zhuǎn)印和肉眼可見的平板篩選策略相結(jié)合，通過(guò)對(duì)影響菌落生長(zhǎng)、酶的表達(dá)和轉(zhuǎn)印成功率的各因素的優(yōu)化，建立了高通量篩選耐高溫β-葡聚糖酶的方法。結(jié)果顯示：每個(gè)LB平板(直徑90mm)用4μl200mg/mlIPTG；IPTG要預(yù)先涂在LB平板上；菌落密度約為100個(gè)/平板；菌落培養(yǎng)時(shí)間為37℃，15小時(shí)；完全鈍化野生型酶的條件為100℃

5、2小時(shí)。對(duì)該方法的穩(wěn)定性考察結(jié)果顯示：該方法的重現(xiàn)性為100％，假陽(yáng)性率為0.16％，假陰性率為12.22％。與其它高通量篩選方法相比，以濾膜為基礎(chǔ)的高通量篩選方法存在許多優(yōu)點(diǎn)，如透明圈清晰，假陽(yáng)性率較低，篩選通量高，操作簡(jiǎn)便，費(fèi)用低等。該方法作為一種固相酶篩選方法，在鑒別熱穩(wěn)定性和低溫下催化活性同時(shí)得到提高的變異體時(shí)非常有效。 為了提高β-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性，利用體外定向進(jìn)化技術(shù)對(duì)編碼β-葡聚糖酶的基因進(jìn)行改造。設(shè)計(jì)的定向進(jìn)化

6、策略包括一輪的隨機(jī)突變和一輪的DNA改組。應(yīng)用建立的高通量篩選方法篩選熱穩(wěn)定性突變體，最終獲得EGs1和EGs2兩株熱穩(wěn)定性突變體。通過(guò)對(duì)野生酶和突變酶的DNA序列和酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)：EGs1和EGs2分別有四個(gè)和五個(gè)氨基酸替換；這些氨基酸替換使EGs1和EGs2突變酶的Tm值分別比野生酶的Tm值(62.5℃)提高了3℃和5℃，達(dá)到了65.5℃和67.5℃；突變酶的最適反應(yīng)溫度也提高了5℃；兩個(gè)突變酶對(duì)地衣多糖的水解能力分別被提高28％

7、和降低21.6％；對(duì)地衣多糖的親和力與野生型的一致，未見改變；在酶的最適pH值上，野生酶和EGs1突變酶為6.5，而EGs2突變酶為7.0；在酶的pH值穩(wěn)定性方面，野生型和突變型β-葡聚糖酶都有較寬的pH穩(wěn)定范圍，在pH6.0-8.5的范圍內(nèi)放置48h，β-葡聚糖酶仍保持80％以上的酶活力。這一結(jié)果說(shuō)明了定向進(jìn)化在提高酶的熱穩(wěn)定性方面是比較有效的。 遺傳穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果表明：EGs1和EGs2突變株傳代50次后，質(zhì)粒穩(wěn)定性良好，重

8、組表達(dá)的目的產(chǎn)物活性保持恒定，說(shuō)明突變株的遺傳穩(wěn)定性良好。 通過(guò)搖瓶發(fā)酵分析，突變株EGs2最佳生長(zhǎng)條件為：裝液量40ml，接種量1.5％，初始pH值為6.5-7.0。在此條件下，菌體生長(zhǎng)6小時(shí)后進(jìn)入穩(wěn)定期。分別用IPTG和乳糖作為誘導(dǎo)劑，對(duì)適于菌體生長(zhǎng)和目的產(chǎn)物表達(dá)的條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示：IPTG和乳糖都可以作為重組工程菌的誘導(dǎo)劑；乳糖的誘導(dǎo)效果稍好于IPTG的誘導(dǎo)效果；IPTG濃度對(duì)菌體生物量和目的產(chǎn)物表達(dá)量影響不大，而乳

9、糖濃度對(duì)菌體生物量和目的產(chǎn)物表達(dá)量的影響較大。溫度對(duì)目的產(chǎn)物在上清液中的積累影響較大，對(duì)菌體生物量的影響不大。合適的IPTG誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)時(shí)間，4小時(shí)；誘導(dǎo)劑濃度，0.1mmol/L；誘導(dǎo)溫度，34℃。合適的乳糖誘導(dǎo)條件為：誘導(dǎo)時(shí)間，4小時(shí)；誘導(dǎo)劑濃度，10mmol/L；誘導(dǎo)溫度，32℃。 通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，篩選出能提高β-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的保護(hù)劑，并設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化復(fù)合保護(hù)劑組成。結(jié)果表明白蛋白，明膠和CaCl2.2H2O都能

10、明顯提高β-葡聚糖酶的穩(wěn)定性；復(fù)合保護(hù)劑配方為：0.8％(w/v)白蛋白，2％(w/v)明膠，1mmol/LCaCl2.2H2O。含保護(hù)劑的β-葡聚糖酶的Tm值比不含保護(hù)劑的酶的Tm值高4℃，加保護(hù)劑和未加保護(hù)劑的酶液在36.2℃下的熱降解速度分別為-0.0398和-0.084，這說(shuō)明保護(hù)劑對(duì)酶的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性都起到了較好的保護(hù)作用。 利用加速實(shí)驗(yàn)估算了β-葡聚糖酶在不同溫度下的儲(chǔ)存壽命。選擇的實(shí)驗(yàn)溫度為28℃，36.2℃

11、，45℃。將盛有β-葡聚糖酶的樣品瓶放入不同溫度的水浴中，不同時(shí)間取樣并測(cè)定β-葡聚糖酶活性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理結(jié)果得出：β-葡聚糖酶在45℃，36.2℃和28℃活性損失10％所需時(shí)間為1.36d，4.37d和20.09d?；钚該p失50％所需時(shí)間為8.5d，25.47d，104.9d。由壽命估算曲線估算出β-葡聚糖酶在25℃,20℃，15℃，4℃和0℃時(shí)，活性損失10％需要的時(shí)間分別為30.7d，67.0d，145.9d，2.21年，4