嗜熱毛殼菌（Chaetomium thermophilium）熱穩(wěn)定性β-1，3-葡聚糖酶的純化 特性及cDNA克隆.pdf

1、β-1,3-葡聚糖酶屬于水解β-葡聚糖的葡聚糖酶系,在自然界中存在廣泛。β-1,3-葡聚糖酶參與生物的生長發(fā)育、新陳代謝等生理過程,是植物抗真菌病的重要物質(zhì)之一。低分子量β-1,3-葡聚糖對異體宿主防御系統(tǒng)具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)和活化作用,是一種免疫系統(tǒng)的活化劑。β-1,3-葡聚糖酶可應(yīng)用于啤酒和葡萄酒釀造工程中酒的澄清、作為飼料添加劑、酵母原生質(zhì)體制備、多糖的改性增溶、植物有害真菌防治與真菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)分析、醫(yī)療保健等方面。 來源于嗜熱

2、真菌的各種酶,因?yàn)樗麄兊臒岱€(wěn)定性,引起了研究者們的高度關(guān)注。目前,雖然有部分研究報(bào)告報(bào)道了一些來源于真菌的β-1,3-葡聚糖酶,但是還未見有關(guān)嗜熱真菌的熱穩(wěn)定性β-1,3-葡聚糖[酶的報(bào)道。嗜熱毛殼菌(C. thermophilum)是一種廣泛分布的嗜熱真菌,是真核生物中生長上限溫度很高的一種真菌。本研究分離純化了嗜熱毛殼菌的一種胞外β-1,3-葡聚糖酶,并研究了他的部分生理生化特性,并且對嗜熱毛殼菌的β-1,3-葡聚糖酶cDNA進(jìn)行了

3、克隆。 嗜熱毛殼菌 (C. thermophilum)在以麥麩為碳源的培養(yǎng)基中誘導(dǎo)產(chǎn)生的胞外β-1,3-葡聚糖酶粗酶液經(jīng)80％飽和(NH4)2SO4沉淀、Phenyl-Sepharose疏水層析、DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子層析和凝膠層析等步驟獲得了凝膠電泳蛋白帶單一的β-1,3-葡聚糖酶。所得樣品的比活力為45.4 U·mg-1,純化倍數(shù)17.2倍,活力回收率為26.24。SDS-PAGE測得所分離純

4、化酶蛋白的分子量約為76.3kDa。 分離得嗜熱毛殼菌β-1,3-葡聚糖酶的最適反應(yīng)溫度和pH分別為60℃和6.0。在pH6.0條件下,該酶在50℃以下穩(wěn)定,60℃保溫60min后,仍保留90％的酶活性,70℃的半衰期為20min。在酶與底物反應(yīng)的條件下,加入不同的12種金屬離子,使其終濃度為0.05mol/L,以不加金屬離子的酶活為100％,測定其相對酶活。不同金屬離子對酶活力的影響測定結(jié)果表明,Ca2+、Na+、對酶有激活作

5、用；而一些重金屬離子如Co2+、Zn2+、Mg2+、Al3+、Fe2+、Cu2+、Ag+對酶有顯著的抑制作用；K+、Mn2+、Ba2+對酶活的影響不大。利用液相色譜分析β-1,3-葡聚糖酶水解海帶多糖產(chǎn)物表明分離純化得到的β-1,3-葡聚糖酶是外切型β-1,3-葡聚糖酶。 采用Edman降解法測定嗜熱毛殼菌(C. thermophilum)β-1,3-葡聚糖酶N端8個氨基酸的序列為HWLGDIPH。與Genbank中其他真菌β-

6、1,3-葡聚糖酶的氨基酸序列同源性不高,氨基酸序列中只有WL和D與個別真菌β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列有一定的同源性。 在麥麩誘導(dǎo)培養(yǎng)基上接種嗜熱毛殼菌(C. thermophilum),誘導(dǎo)產(chǎn)β-1,3-葡聚糖酶,接種4天后在培養(yǎng)基表面刮取菌絲,提取mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。根據(jù)測得的純化的C. thermophilum熱穩(wěn)定β-1,3-葡聚糖酶的N-端氨基酸序列和其他微生物β-1,3-葡聚糖酶同源保守序列設(shè)計(jì)簡并引物

7、,通過RT-PCR的方法,克隆了該嗜熱毛殼菌(C.thermophilum)的兩個編碼β-1,3-葡聚糖酶的cDNA片段glu-N和glu-I,Genbank的登陸號分別為EU744253和EU746500。β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I的cDNA序列為1267bp,包含一個1263bp的開放閱讀框ORF,編碼421個氨基酸的蛋白質(zhì),β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N的cDNA序列為1273bp,包含一個1269bp的開放閱讀框OR

8、F,編碼423個氨基酸的蛋白質(zhì)。兩段序列編碼區(qū)推測出的氨基酸序列與真菌β-1,3-葡聚糖酶氨基酸序列同源性比較,β-1,3-葡聚糖酶基因glu-N編碼氨基酸序列與Ampelomyces quisqualis,Coniothyrium minitans β-1,3-葡聚糖酶氨基酸的同源性為52％,β-1,3-葡聚糖酶基因glu-I編碼氨基酸序列與Aspergillus fumigatus, Hypocrea lixii, Cochliob