通過(guò)體外分子進(jìn)化技術(shù)提高淀粉液化芽孢桿菌BS5582β-1,3-1,4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性的研究.pdf

1、β-1,3-1,4-葡聚糖屬植物細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)性非淀粉多糖,是以混合(1→3)和(1→4)β-糖苷鍵連接形成的D型葡萄糖聚合物,在大麥整粒和胚乳中含量高達(dá)4.0％-8.0％。Β-1,3-1,4-葡聚糖酶(EC3.2.1.73)能有效水解β-1,3-1,4-葡聚糖,主要產(chǎn)物為三糖(3-O-β-D-纖維二糖-D-葡萄糖)和四糖(3-O-β-D-纖維三糖-D-葡萄糖)。在啤酒工業(yè)中,β-葡聚糖酶可降低麥汁粘度,提高麥汁濾速及得率,改善啤酒風(fēng)味,

2、保持成品酒穩(wěn)定性。目前市售β-葡聚糖酶多為用于飼料加工的粗酶制劑,酶熱穩(wěn)定性較差。啤酒工業(yè)使用復(fù)合酶中的β-葡聚糖酶溫度穩(wěn)定性范圍也較窄,從而限制了啤酒糖化工藝和啤酒工業(yè)的發(fā)展。因此,為適應(yīng)行業(yè)發(fā)展需要,迫切需要開(kāi)發(fā)耐高溫的β-葡聚糖酶,提高我國(guó)啤酒產(chǎn)業(yè)的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。
　　 本研究首先應(yīng)用基于易錯(cuò)PCR隨機(jī)突變的體外定向進(jìn)化技術(shù),來(lái)提高淀粉液化芽孢桿菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶的熱穩(wěn)定性。利用建立的基于96微孔板高通量篩選模型

3、,經(jīng)過(guò)兩輪定向進(jìn)化與高通量篩選,共篩選得到三株熱穩(wěn)定性明顯提高突變體2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03。將野生型β-葡聚糖酶基因和熱穩(wěn)定性提高的突變基因的高效表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳親和層析柱純化后,酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定表明突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的T50值分別比野生酶(53℃)提高2.2℃、5.5℃和3.5℃。突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03在60℃下的半衰期t1/2.60℃(min)分別比野生

4、酶(18 min)提高4 min,13 min和17 min。突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Vmax值為286μmol/(mg·min),304μmol/(mg·min)和279μmol/(mg·min),分別比野生型下降8.3％,2.6％和10.6％。突變酶2-JF-01、2-JF-02和2-JF-03的Km值分別為6.76 mg/mL、6.19μmg/mL和6.84 mg/mL,與野生型(6.29mg/mL)

5、基本相同。序列分析表明,三個(gè)突變體共發(fā)生7個(gè)氨基酸替代:2-JF-01(N36S,G213R),2-JF-02(C86R,S115I,N150G)和2-JF-03(E156V,K105R)。同源建模表明,7個(gè)氨基酸替代中5個(gè)位于蛋白質(zhì)表面或表面洞穴中,42.8％的替代氨基酸是精氨酸,表明精氨酸在提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶熱穩(wěn)定性中起重要的作用。
　　 本研究基于PyMOL軟件,將定向進(jìn)化得到的多株突變體所包含的氨基酸突變,

6、逐一進(jìn)行單點(diǎn)突變,并借助foldX軟件對(duì)各個(gè)含有單一突變位點(diǎn)的酶蛋白變種逐一進(jìn)行分子修復(fù)和分子自由能(△G)計(jì)算,根據(jù)分子自由能與熱穩(wěn)定性負(fù)相關(guān)的關(guān)系,七個(gè)氨基酸突變中,野生型β-葡聚糖酶第156位由谷氨酸突變?yōu)槔i氨酸后,酶蛋白分子的自由能由野生型的15.80 kcal/moL下降至14.28 kcal/moL,下降9.6％,在所有突變中下降幅度最大。本研究基于四引物PCR介導(dǎo)的定點(diǎn)突變技術(shù),將野生型β-葡聚糖酶156位的谷氨酸突變?yōu)槔i