重組大腸桿菌高效分泌表達(dá)雜合β-1，3-1，4-葡聚糖酶.pdf

1、β—葡聚糖酶是重要的工業(yè)用酶，可有效消除谷物β—葡聚糖在釀造和飼料工業(yè)中產(chǎn)生的負(fù)面影響。國內(nèi)對β—1，3—1，4—葡聚糖酶的研究還處于初級階段，天然菌株的產(chǎn)酶量及酶的性能滿足不了實(shí)際應(yīng)用。然而，分子生物學(xué)、基因工程方法的應(yīng)用為其提供了契機(jī)。現(xiàn)在對β—1，3—1，4—葡聚糖酶的研究主要集中在構(gòu)建基因工程菌株來提高酶的產(chǎn)量和性能方面。本研究應(yīng)用工業(yè)生物技術(shù)進(jìn)行了一系列的探索，旨在找到一種可持續(xù)發(fā)展的，可用于產(chǎn)業(yè)化、規(guī)模化的生產(chǎn)β—1，3—1

2、，4—葡聚糖酶的方法。主要研究內(nèi)容包括： 1．發(fā)酵罐流加培養(yǎng)重組大腸桿菌JM109—pLF3生產(chǎn)β—1，3—1，4—葡聚糖酶在原有優(yōu)化培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，優(yōu)化了發(fā)酵工藝，在7 L發(fā)酵罐上進(jìn)行了分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)酶研究。結(jié)果表明，在12～32 h之間向發(fā)酵罐內(nèi)恒速流加雙倍濃縮的培養(yǎng)基氮源，對細(xì)胞生長和產(chǎn)酶有極大的促進(jìn)作用。最大酶活增長到1680 U/mL，比間歇發(fā)酵提高了231.40％；最大細(xì)胞密度為7.67 g/L，是間歇發(fā)酵3.44倍

3、。 2．高效分泌表達(dá)β—1，3—1，4—葡聚糖酶重組大腸桿菌的構(gòu)建 將熱穩(wěn)定性較好的雜合β—1，3—1，4—葡聚糖酶表達(dá)基因(bgl)插入質(zhì)粒pET-22b(+)，并插入kil—Km分泌盒，得到了新的β—葡聚糖酶表達(dá)質(zhì)粒pET-22—bgl—(kil—Km)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌E． coli JM109和BL21(DE3)。通過SDS—PAGE證明了含有質(zhì)粒pET-22—bgl—(kil—Km)的重組菌株具有目的

4、蛋白的高效分泌表達(dá)的功能。 3．響應(yīng)面法優(yōu)化重組E． coli BL21(DE3)—pET-22—bgl—(kil—Km)產(chǎn)酶培養(yǎng)基 在TB培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，通過單因素實(shí)驗(yàn)選擇乳糖為最佳碳源，酪蛋白胨為最佳氮源。在單因素優(yōu)化基礎(chǔ)上采用Box—Behnken設(shè)計(jì)法和RSM響應(yīng)面分析法考察主要影響因素乳糖濃度、酪蛋白胨濃度和碳氮比三因素的的交互作用。確定了重組E． coli BL21(DE3)—pET-22—bgl—(kil

5、—Km)產(chǎn)酶的優(yōu)化培養(yǎng)基配方為(g/L)：酪蛋白胨33.39，乳糖8.03，甘油9.15，NaCl10.0，KH2PO42.31，K2HPO412.54。利用優(yōu)化培養(yǎng)基在37℃、150 rpm條件下，搖瓶培養(yǎng)32.5 h，酶活達(dá)到1242.94 U/mL，比初始培養(yǎng)基提高了3.3倍。 4．重組酶的分離純化和酶學(xué)性質(zhì)表征 利用Ni2+與6×His標(biāo)簽特異性結(jié)合的性質(zhì)利用親和層析純化重組酶，該方法將目的蛋白純化了7.69