白蟻內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因的克隆、表達(dá)及分子改造.pdf

1、纖維素(Cellulose)是地球上最豐富的有機(jī)物質(zhì)，它是光合作用最主要的產(chǎn)物，同時(shí)也是最豐富的可再生資源，地球上每年光合作用可產(chǎn)生大于100億噸的植物干物質(zhì)，其中一半以上是纖維素和半纖維素。但纖維素的利用目前尚未完全開發(fā)，隨著地球石化能源短缺和枯竭的日趨嚴(yán)峻，人類把眼光轉(zhuǎn)向了對(duì)纖維素的利用，利用纖維素酶將纖維素降解為可發(fā)酵的單糖，進(jìn)而發(fā)酵生產(chǎn)乙醇。然而目前發(fā)現(xiàn)的纖維素酶都存在活力低和反應(yīng)速度慢的缺點(diǎn)，因此尋找新的或者通過改造現(xiàn)有的纖維

2、素酶基因獲得活力更高纖維素酶是解決纖維素開發(fā)利用的關(guān)鍵問題。 本研究提取了臺(tái)灣家白蟻總RNA通過RT-PCR擴(kuò)增出白蟻內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因，并分別構(gòu)建了表達(dá)內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶的大腸桿菌和釀酒酵母表達(dá)載體。利用金屬鎳親和層析對(duì)大腸桿菌表達(dá)的內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶進(jìn)行純化，CMC酶活檢測(cè)顯示純化酶的最適溫度和最適pH值分別為42℃、6.5；內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶的Vmax為0.071mg/ml*min，Km

3、值為80.2712mg/ml，比活力為130544U/mg。利用定點(diǎn)突變對(duì)白蟻內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶基因進(jìn)行改造，首先是借助計(jì)算機(jī)根據(jù)白蟻內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶的同源建模三維結(jié)構(gòu)信息，利用ProSA2003軟件根據(jù)能量(knowledge-based potentials)最低化原則，計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)確定白蟻內(nèi)切-β-1,4-葡聚糖酶氨基酸飽和突變位點(diǎn)，通過同源建模分析表明53D、56D和411E三個(gè)位點(diǎn)都是活性中心位點(diǎn)。利用兼并

4、引物對(duì)53，56，411位點(diǎn)的氨基酸分別進(jìn)行飽和突變，篩選到三個(gè)有活力的突變子C53、E53和C56。對(duì)突變酶進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)的研究表明，C53的最適溫度、最適pH、米氏常數(shù)、Vmax和比活力分別為42℃、6.5、37.683 mg/mL、0.0334umol/mL*min、9.912 U/mg；突變酶E53的最適溫度、最適pH、米氏常數(shù)、Vmax和比活力分別為37℃、6.5、93.819mg/mL、0.124umol/mL*min、16.