嗜熱液化芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆和表達(dá).pdf

1、嗜熱液化芽孢桿菌(Bacillus thermoliquefaciens-NL)產(chǎn)生的內(nèi)切葡聚糖酶具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性,工業(yè)應(yīng)用潛力大.本研究克隆了嗜熱液化芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶基因,對(duì)基因進(jìn)行定向進(jìn)化,選用不同的表達(dá)系統(tǒng)對(duì)不同的重組酶基因進(jìn)行表達(dá).主要研究結(jié)果如下: 1、通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的內(nèi)切葡聚糖酶基因的同源序列比對(duì),選擇高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物,克隆了嗜熱液化芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶基因Cel5A.測(cè)序表明,其長(zhǎng)度為1,500 bp,編

2、碼499個(gè)氨基酸,N端起始的29個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列,其全長(zhǎng)理論分子質(zhì)量為55.2kDa.該基因和已報(bào)道的桿菌纖維素酶序列具有很高的同源性,如與Bacillus Subtilis. PAP115(Z29076)、B. subtilis.CK-2(X67044)的DNA序列同源性分別為99.8％、99.73％,所編碼蛋白同源性分別達(dá)到99.6％、99.4％,已公布基因中的Glu490,Thr496分別被Arg和Ala所代替. 2、

3、將內(nèi)切葡聚糖酶基因全序列(Cel5A Ⅰ)和成熟肽序列(Cel5A Ⅱ)分別定向插入到原核表達(dá)載體pET-20b上,得到重組質(zhì)粒pET-20b-Cel5A Ⅰ和pET-20b-Cel5A Ⅱ,均在大腸桿菌BL21 CodonPlus(DE3)-RIL中得以表達(dá),單位發(fā)酵液的酶活力分別為0.0238U/ml和0.0242U/ml,SDS-PAGE分析表明Cel5A Ⅱ的表達(dá)量有所提高,但大部分表達(dá)蛋白為無(wú)活性的包涵體. 3、構(gòu)建重

4、組質(zhì)粒pPICZαB-Cel5A Ⅱ并電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115獲得基因工程菌GS115Cel5A Ⅱ,篩選得到的重組菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)后,上清液的發(fā)酵活力最高為0.089U/ml,是大腸桿菌表達(dá)量的3.7倍. 4、根據(jù)其氨基酸序列以及畢赤酵母偏愛(ài)密碼子,人工設(shè)計(jì)并通過(guò)重疊延伸PCR法合成內(nèi)切葡聚糖酶成熟肽基因(Cel5AⅢ),長(zhǎng)為1,427bp.構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαB-Cel5AⅢ并電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115獲得基因工程菌GS1