幾丁質(zhì)酶和內(nèi)切葡聚糖酶編碼基因的克隆及重組芽孢桿菌的構(gòu)建.pdf

1、該研究旨在從兩株生防菌中分別克隆幾丁質(zhì)酶和內(nèi)切葡聚糖酶的編碼基因,并進(jìn)行測序.將所獲得的基因同穿梭質(zhì)粒連接,轉(zhuǎn)化野生型植病生防芽孢桿菌菌株,通過平板拮抗實(shí)驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)檢測獲得的轉(zhuǎn)化子對病原菌的拮抗作用的大小.本實(shí)驗(yàn)室從泰安效區(qū)小麥根際及來自澳大利亞的小麥根際土樣中,經(jīng)分離篩選出兩株芽孢桿菌,枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Ap113和巨大芽孢桿菌(B.megaterium)Ap25,兩個菌株對小麥紋枯病和全蝕病都有防治

2、效果;利用幾丁質(zhì)培養(yǎng)基和羧甲基纖維素培養(yǎng)基對這兩株菌進(jìn)行酶活性檢測,已證實(shí)這兩株菌分別具有幾丁質(zhì)酶和內(nèi)切葡聚糖酶活性.幾丁質(zhì)酶基因的克隆:根據(jù)GeneBank上已有的枯草芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶基因的編碼序列,設(shè)計一對簡并引物,根據(jù)引物的Tm值和GC含量選擇適宜的PCR條件進(jìn)行PCR,PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α,藍(lán)白斑篩選得到23株菌株,在幾丁質(zhì)平板上篩選陽性克隆子4株.質(zhì)粒分析證明克隆子中含有重組質(zhì)粒,外源插

3、入片段大小為2.6kb左右,與PCR最初產(chǎn)物的大小一致.測序后在GeneBank上進(jìn)行序列比較,該基因片段同編號為2634966的枯草芽孢桿菌全序列的2599451到2812870(功能未知)有85﹪的同源性,但同已發(fā)表的13種幾丁質(zhì)酶的基因(包括枯草芽孢桿菌幾丁質(zhì)酶基因)的同源性很低,只有30﹪.盡管同源性比較低,但酶活性檢測發(fā)現(xiàn)該基因片段具有幾丁質(zhì)酶活性,認(rèn)為此PCR片段含有幾丁質(zhì)酶編碼基因的全序列或部分序列,此基因片段是一個新基因