內切葡聚糖酶基因克隆、表達、純化及免疫學鑒定.pdf

1、本試驗采用RT-PCR法以黑曲霉(Aspergillus niger)菌株總：RNA為模板克隆內切葡聚糖酶基因cDNA序列。PCR產物直接測序表明EG-B基因全長999bp，GC堿基含量為53.95％，以ATG為起始密碼子，TGA為終止密碼子，編碼332個氨基酸組成的多肽，與參考內切葡聚糖酶Eng1基因(Genebank NO.AF331518)核苷酸同源性為98％，氨基酸同源性為99％。。氨基酸序列分析表明該內切葡聚糖酶屬于糖基水解酶

2、家族5。將該基因擴增至pMD19-T simple載體并轉化至大腸桿菌JM109中，構建重組質粒CTB256-T-1和CTB256-T-2。其中CTB256-T-2 PCR擴增出的目的基因成熟編碼區(qū)與PCR產物直接測序結果完全一致。 在上述試驗的基礎上，通過限制性內切酶EcoR I/HindⅢ完成了原核表達載體構建：將經雙酶切鑒定正確的原核融合表達質粒pET-28a/EG-B在大腸桿菌BL21(DE3)中充分表達；并利用原核表

3、達載體pET-28a上N端融合組氨酸標簽，將EG-B基因表達的目的蛋白經Ni<'2+>-chelating和Heparin樹脂逐級分離純化：純化后的目的蛋白作抗原免疫家兔，制備多克隆抗體，Western blotting檢測確定EG-B基因表達的重組蛋白和黑曲霉(Aspergillus niger)菌株天然蛋白具有相同的抗原顯色反應。試驗結果如下：(1)RT-PCR法克隆的EG-B基因與已發(fā)表黑曲霉(Aspergillus niger)

4、編碼內切葡聚糖酶Eng1基因(Genebank NO.AF331518)核苷酸同源性為98％，氨基酸同源性為99％；(2)EG-B基因表達的目的蛋白相對分子質量為36.52KDa，蛋白的等電點為4.115； (3)EG-B基因表達的目的蛋白經多級分離純化后酶比活力為180.8U/mg；(4)EG-B基因表達的重組蛋白和黑曲霉(dspergillus niger)菌株天然蛋白具有相同的抗原顯色反應。以上試驗結果可以得到同一個結論，即編碼黑