高產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選、鑒定及內(nèi)切葡聚糖酶高表達(dá)基因工程菌的構(gòu)建.pdf

1、纖維素在地球上分布廣泛，隨處可見，我國地大物博，資源豐富，纖維素資源也是極其豐富，但是，由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、不易水解等特點，大大限制了其利用范圍。如果可以利用大量微生物，讓它們產(chǎn)生降解纖維素的酶，通過酶將纖維素分解轉(zhuǎn)化，不僅可以解決環(huán)境污染的問題，而且可以合理利用纖維素資源。此外，纖維素資源的合理利用，對開發(fā)飼料資源，生產(chǎn)農(nóng)業(yè)能源，發(fā)展畜牧業(yè)資源，減輕人類對環(huán)境的污染都具有重大的意義。
　　雖然人們在纖維素酶的篩選方面，做了大量研究工

2、作，并且也獲得了一定的成果，但是截止到現(xiàn)在，產(chǎn)酶能力高的菌株由于其自身的諸多局限，沒有被很好的利用。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，有關(guān)β-內(nèi)切葡聚糖酶基因的克隆和表達(dá)的研究越來越深入，但是，由于各種條件如耐熱性差，穩(wěn)定性差等的限制，真正轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)實踐的基因工程菌少之又少。因此，利用合理的方法構(gòu)建高表達(dá)β-內(nèi)切葡聚糖酶基因工程菌并應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，將大大加快纖維質(zhì)原料在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的利用步伐。
　　1.本實驗采用剛果紅染色法(Congo red

3、staining)，選擇灌木叢、腐木、稻桿堆積等纖維素含量豐富的土壤中取樣，通過羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基富集后分離單菌落，以剛果紅染色法(Congo red staining)進(jìn)行復(fù)篩，篩出6株水解圈大，CMC酶活力高的菌株，編號后，對它們進(jìn)行16S rDNA及生理生化的鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2號為蠟狀芽孢桿菌（Waxy bacillus），5號為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，9號為巨大芽孢桿菌(Huge bacillus

4、)，10號為地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)，11號為微小桿菌（Tiny bacteria），12號為綠色木霉（Greentrichoderma viride）。利用候選菌株對兩種不同的纖維質(zhì)材料麩皮和米糠進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，DNS法測量了OD值，計算出發(fā)酵后的酶活力，結(jié)果顯示，地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)發(fā)酵后的酶活力最強(qiáng)，麩皮和米糠作為底物發(fā)酵后酶活值分別達(dá)到3437U/ml和85

5、41U/ml，為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及畜牧業(yè)帶來了巨大的的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益。
　　2.在上述候選菌株中，本研究選擇酶活力最大的10號菌株地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)作為研究對象，對其生長條件包括發(fā)酵溫度、時間及含水量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn):當(dāng)培養(yǎng)溫度為30℃，培養(yǎng)時間達(dá)到60 h，初始水分含量為40％時，其產(chǎn)酶能力達(dá)到最大。為進(jìn)一步利用此菌株進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)和飼料研究奠定了理論基礎(chǔ)，也為以后的應(yīng)用指明了方向。

6、r>　　3.依據(jù)已公布的纖維素內(nèi)切葡聚糖酶基因(www.ncbi.nlm.nih.gov)，設(shè)計特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得一長度為732bp的特異產(chǎn)物，測序后發(fā)現(xiàn)該基因序列與公布的纖維素酶基因片段同源性達(dá)99％，表明成功克隆到該基因。
　　4.在上述獲得的纖維素酶基因兩端引入ECOR1和HandⅢ酶切位點，重新設(shè)計引物獲得PCR產(chǎn)物后，將該纖維素酶基因連接到PET-28a載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，獲得基因工程菌。酶切后進(jìn)行聚丙