豬囊尾蚴cDNA文庫的免疫學(xué)篩選及基因的克隆、表達(dá)及鑒定.pdf

1、目的：從豬囊尾蚴cDNA文庫中篩選免疫學(xué)陽性的編碼基因，克隆、表達(dá)并進(jìn)行鑒定，為臨床豬囊尾蚴患者的免疫學(xué)診斷提供特異的重組抗原。 方法：經(jīng)確診腦囊尾蚴病人血清免疫學(xué)篩選豬囊尾蚴cDNA.文庫，陽性克隆經(jīng)PCR技術(shù)擴(kuò)增噬菌體載體中插入的DNA片段，并將其克隆入pMD.18T載體中，測(cè)序結(jié)果與應(yīng)用EXPASY軟件進(jìn)行分析，獲得完整開放閱讀框(ORF)基因序列，設(shè)計(jì)并合成引物PCR法擴(kuò)增，與T載體連接，轉(zhuǎn)化入XLl-blue大腸桿菌，

2、雙酶切鑒定；再將其亞克隆入表達(dá)載體pET-28a(+)，轉(zhuǎn)化入BL21.大腸桿菌，雙酶切、測(cè)序鑒定后，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE和Western-blot方法觀察表達(dá)結(jié)果。 結(jié)果：經(jīng)cDNA文庫篩選，初步確定NC膜上深黃色單個(gè)噬菌斑為陽性克隆；用上下游載體臂上通用引物PCR法擴(kuò)增出了200-1800bp不同大小的DNA片斷；將其克隆入PMD-18T載體，測(cè)序結(jié)果應(yīng)用EXPASY軟件分析，獲得一個(gè)681bpORF DNA序

3、列；PubMed中blast程序確定為一個(gè)新基因(命名為Tsl)，錄入號(hào)為EU009656；PCR法擴(kuò)增出了一個(gè)681bp左右的DNA片斷，將重組質(zhì)粒pMD-18T-Tsl、pET-28a(+)-rsl分別作BamH Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切，均能得到一個(gè)大小與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物一致的插入片斷，對(duì)插入片斷的測(cè)序結(jié)果表明，Tsl具有一個(gè)長度為681bp的ORF，編碼227個(gè)氨基酸，理論分子量25.86kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為6.68；用IP