幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶基因?qū)ξ鞴线z傳轉(zhuǎn)化的研究.pdf

1、西瓜[Citrullus lanatus(Thunb.)Mantsum.et Nakai]是一種重要的園藝作物，在世界上有4000多年的栽培歷史。西瓜作為國際貿(mào)易中新鮮水果的一個重要組成部分，因其具有香甜口味和芳香氣味而深受廣大消費者喜愛。但是，真菌性病害經(jīng)常發(fā)生并且導致百萬公噸西瓜的損失，利用傳統(tǒng)的方法并不能有效地解決這一問題而且還帶來一些負面影響，例如環(huán)境污染、破壞土壤微生物。此外，西瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄常規(guī)的育種方法很難改變其特性。隨著

2、生物技術(shù)的發(fā)展，基因工程技術(shù)為改良品種提供了有效途徑。
　　 本研究以西瓜自交系W1－4和W1－12為試材，建立了西瓜高效再生體系，并探討了影響農(nóng)桿菌介導法遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素，由于農(nóng)桿菌介導法遺傳轉(zhuǎn)化率極低未能獲得轉(zhuǎn)化植株；本試驗通過子房注射法成功將抗真菌病基因幾丁質(zhì)酶基因(CH5B)和β-1，3－葡聚糖酶基因(BG2)分別導入西瓜中，并對影響西瓜再生體系建立和子房注射法遺傳轉(zhuǎn)化的主要因素進行了探討，建立了西瓜自交系W1－4和W

3、1－12高效再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化條件，本研究為進一步研究子房注射法轉(zhuǎn)基因技術(shù)在西瓜育種中的應用提供了參考依據(jù)，并為創(chuàng)造新的抗真菌病害西瓜品種提供種質(zhì)資源。主要內(nèi)容和結(jié)果包括：⑴建立了西瓜自交系W1－4和W1－12高效再生體系：最佳萌發(fā)培養(yǎng)基為1/8 MS添加瓊脂7.0 g·L-1、蔗糖30 g·L-1；最佳外植體來源兩片子葉仍重疊在一起尚未展開，子葉顏色剛剛由黃色轉(zhuǎn)為淺綠色時的無菌苗；最佳外植體為大小約0.5 cm×0.5 cm帶有上胚軸

4、的子葉節(jié)；最佳不定芽誘導培養(yǎng)基W1－4和W1－12分別為MS+6-BA1.5 mg·L-1+IAA0.2 mg·L-1和MS+6-BA1.0 mg·L-1+IAA0.1 mg·L-1，芽伸長培養(yǎng)基為MS+6－BA0.05 mg·L-1；生根培養(yǎng)基為1/2 MS+IAA0.1 mg·L-1。⑵構(gòu)建了pBI－BG2和pBI－CH5B植物表達載體。⑶確定了西瓜自交系W1-12抗性芽卡那霉素臨界篩選濃度為75 mg·L-1。⑷確定出西瓜自交系W

5、1－12農(nóng)桿菌介導法遺傳轉(zhuǎn)化體系為：預培養(yǎng)2d，用OD600為0.5的工程菌液侵染15 min，在添加30 mg·L-1 AS的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d時轉(zhuǎn)化率最高為2.2％，但未獲得轉(zhuǎn)化植株。⑸確定了子房注射法遺傳轉(zhuǎn)化西瓜的最佳體系：外源DNA溶液濃度為750－1000μg·mL-1；外源DNA最佳導入時間是在西瓜白花授粉后的20h。⑹確定了田間西瓜植株子葉抗生素篩選濃度：西瓜自交系W1－4和W1－12子葉卡那霉素臨界篩選濃度有顯著的基