內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化棉花及轉(zhuǎn)基因植株的再生研究.pdf

1、棉纖維是紡織工業(yè)的重要原料，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)中占有重要地位。因此，從分子水平闡明棉纖維發(fā)育的機(jī)理，具有重要的理論價(jià)值和現(xiàn)實(shí)意義。 該研究利用一個(gè)與擬南芥KOKRIGAⅣ基因(編碼跨膜內(nèi)切-1，4-β-葡聚糖酶)高度同源的棉花基因GhCEL(GenBank accession number：AY574906)成功地構(gòu)建了該基因的RNAi表達(dá)載體和正義表達(dá)載體，將上述兩個(gè)表達(dá)載體通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別轉(zhuǎn)入棉花，試圖闡明該基因的過(guò)量表達(dá)和抑制

2、表達(dá)對(duì)受體棉花植株及其棉纖維品質(zhì)的作用，為今后進(jìn)一步將該基因應(yīng)用于植物的遺傳改良奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 1.棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化 研究結(jié)果表明，在以下胚軸作為受體的棉花遺傳轉(zhuǎn)化體系中，轉(zhuǎn)化初期將愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的KNO<,3>加倍，有利于愈傷的起動(dòng)和增殖；潮霉素篩選的起始濃度為5mg/L最佳，而在愈傷生長(zhǎng)和增殖階段，潮霉素濃度可增加到10mg/L，然后經(jīng)過(guò)2～3次繼代即可去掉潮霉素，有利于愈傷的生長(zhǎng)和分化。

3、2.目的基因的轉(zhuǎn)化及胚性愈傷系的獲得 利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法將構(gòu)建的GhCEL基因的RNAi表達(dá)載體和正義表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)入棉花受體W<,0>中，在篩選培養(yǎng)基中當(dāng)抗性愈傷長(zhǎng)到直徑為0.5cm左右時(shí)將其從外植體上剝離下來(lái)，轉(zhuǎn)入含10mg/L潮霉素的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待生長(zhǎng)至直徑為1.0cm左右即轉(zhuǎn)入胚性愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，總共獲得了62個(gè)分化的抗性愈傷系。經(jīng)過(guò)GUS檢測(cè)和PCR驗(yàn)證，其中有陽(yáng)性愈傷系42個(gè)，平均陽(yáng)性率為67.7％。

4、 3.轉(zhuǎn)化植株的分子檢測(cè) 總共獲得轉(zhuǎn)基因再生植株300多株，用Hpt基因特異引物對(duì)其中的239株進(jìn)行了PCR檢測(cè)，初步確定190株為陽(yáng)性，陽(yáng)性率為79.5％。110株轉(zhuǎn)正義基因的再生植株除了用Hpt基因特異引物擴(kuò)增外，還設(shè)計(jì)了啟動(dòng)子.基因特異引物進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果表明，兩種引物擴(kuò)增得到的陽(yáng)性率有較大差異，用啟動(dòng)子.基因特異引物擴(kuò)增的陽(yáng)性率為52.7％，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Hpt基因特異引物擴(kuò)增得到的陽(yáng)性率79.1％。只有兩次PCR擴(kuò)增結(jié)果

5、都為陽(yáng)性的植株才被初步認(rèn)為是轉(zhuǎn)基因植株。以Hpt基因片段作為探針，隨機(jī)取轉(zhuǎn)RNAi基因的T<,0>代7株P(guān)CR陽(yáng)性植株做Southem雜交。結(jié)果證明Hpt基因已經(jīng)整合到植物基因組中。 4.轉(zhuǎn)基因植株的嫁接和移栽 總共嫁接了50株轉(zhuǎn)RNAi．基因的植株，成活35株，成活率可達(dá)70％以上。而移栽的20株再生苗最后成活的只有4株，成活率不到20％。轉(zhuǎn)RNAi基因T<,0>代植株與受體W<,0>的再生植株相比，株型除了個(gè)別的變得