棉花離體培養(yǎng)再生體系的研究及抗黃萎病轉(zhuǎn)基因棉花植株的培育.pdf

1、細(xì)胞工程和基因工程的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用為植物的遺傳改良開拓了廣闊的前景。植物抗病基因工程是植物基因工程的一個(gè)分支，它是將外源抗病基因通過各種遺傳方法導(dǎo)入到植物基因組中并培育抗病品種。棉花是我國第一大經(jīng)濟(jì)作物，棉花黃萎病被稱為棉花的“癌癥”，本研究以湖南重要的優(yōu)良品種湘棉10號(hào)、湘棉15號(hào)為研究材料，采用花粉管通道法將溶菌酶基因?qū)雰善贩N均獲得了抗黃萎病的棉花植株，同時(shí)進(jìn)行了湘棉10號(hào)離體培養(yǎng)再生體系建立的研究為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化外源基因奠定

2、了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下： 1. 湘棉10號(hào)再生體系建立的研究 (1)外植體類型是影響棉花愈傷組織誘導(dǎo)的重要因素。不同外植體在相同激素組合下，愈傷誘導(dǎo)率不同。湘棉10號(hào)的愈傷組織誘導(dǎo)率大小順序?yàn)橄屡咻S>子葉>胚根。 (2)以下胚軸為外植體，通過愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代和分化，摸索出愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代和分化的最適基本培養(yǎng)基是MSB：愈傷組織的誘導(dǎo)、繼代和分化的最適碳源是葡萄糖：最適誘導(dǎo)、繼代和分化培養(yǎng)基為MSB+ZT0.

3、1mg/L：不同培養(yǎng)基和激素配比的成苗率不同，SH+IAAO.2mg/L+KT0.2mg/L成苗率最高達(dá)13.6％：生根的最適培養(yǎng)基是Ms+Ihh0.1mg/L，生根率高達(dá)100％。 (3)愈傷組織的誘導(dǎo)和繼代表明，愈傷組織形成的快慢、多少與激素、外植體種類、溫度和基因型有關(guān)。2，4-D的添加有利于愈傷組織的誘導(dǎo)和形成但未能直接誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織，ZT的單獨(dú)使用則可直接誘導(dǎo)獲得少量的胚性愈傷組織；同時(shí)研究表明溫度影響愈傷組織的

4、誘導(dǎo)，最適溫度為28℃左右。 (4)在防褐的研究中發(fā)現(xiàn)對基本培養(yǎng)基的改良，選擇適宜的激素組合以及添加防褐物質(zhì)如活性碳，PVP等都對降低愈傷組織的褐化有明顯的作用。KT+6-BA激素組合可以明顯降低褐化，而KT、IAA、6-BA三種激素的單獨(dú)應(yīng)用效果對愈傷組織的褐化改善不明顯。 2. 花粉管通道法獲得轉(zhuǎn)溶菌酶基因植株 以湘棉10號(hào)、湘棉15號(hào)為研究材料，采用花粉管通道法將溶菌酶基因?qū)?，在遺傳轉(zhuǎn)化中，摸索出了該方法

5、轉(zhuǎn)化的較佳位置是從果枝第2果臺(tái)開始至第6果臺(tái)，轉(zhuǎn)化時(shí)間應(yīng)選擇開花約24小時(shí)的自交棉花進(jìn)行注射，其成鈴率較高而且收獲的擬轉(zhuǎn)化種子數(shù)量最多，注射方式以對準(zhǔn)中軸胎座的中部位置垂直插入子房最佳，其轉(zhuǎn)化率達(dá)9％而且此種注射方式減少對子房的傷害提高了成鈴率。采用抗生素篩選最后篩選得到23株抗卡那霉素湘棉10號(hào)植株和9株抗G418湘棉15號(hào)植株。經(jīng)分子生物學(xué)方法PCR，PCR-SOUTHERN檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：23株抗卡那霉素湘棉10號(hào)植株中1株不含選

6、擇標(biāo)記基因NPTⅡ只含溶菌酶基因，同時(shí)獲得4株只含選擇標(biāo)記基因不含溶菌酶基因植株，證實(shí)其他18株轉(zhuǎn)溶菌酶基因棉花中溶菌酶基因和選擇標(biāo)記基因NPTⅡ均已整合在棉花基因組中，9株抗G418的湘棉15號(hào)植株中2株只含選擇標(biāo)記基因不含溶菌酶基因植株，證實(shí)其他7株轉(zhuǎn)溶菌酶基因棉花中溶菌酶基因和選擇標(biāo)記基因NPTⅡ均已整合在棉花基因組中。 3. 轉(zhuǎn)基因植株初步的抗性測試 采用菌液澆根法和針刺葉片噴灑法兩種方法對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行初步的抗